Minuman Tuak Aren dari Indonesia Mengandung Enzim Fibrinolitik yang Baik untuk Kesehatan

Beberapa koloni yang terbentuk kemudian ditumbuhkan kembali pada agar skim milk (SMA media) dan diikubasi kembali pada suhu 37oC overnight. Koloni dari sampel tuak aren dan nira yang membentuk zona bening terbesar kemudian ditumbuhkan kembali atau dilakukan refreshment pada SMA media lagi dan diinkubasi lagi pada suhu 37oC overnight (Johnson et al. 2015).

Kedua, diproduksi enzim mentah dari koloni hasil refreshment yang kemudian dicampurkan pada media cair SM dan diinkubasi di suhu 37oC selama 24 jam dan 48 jam pada 120 rpm. Sebanyak 250 L hasil yang didapatkan kemudian dipipet ke dalam microtiter 4 kali perlakuan dan diukur konsentrasi protein dari enzim mentah menggunakan microplate reader ELISA pada panjang gelombang 620 nm. 

Pada conical tube, sisa enzim ditambahkan dengan natrium azida konsentrasi 0.2% dan disentrifugasi selama 15 menit pada 10.000 g di suhu 4oC. Setelah proses ini selesai, dilanjutkan dengan langkah berikutnya, yaitu mengidentifikasi keberadaan aktifitas enzim fibrinolitik dari sampel tuak aren yang telah diisolasi pada langkah sebelumnya (Johnson et al. 2015).

Untuk menguji apakah ada enzim fibrinolitk, dilakukan screening menggunakan teknik zimogram dengan substrat fibrinogen 0.1% w/v. Langkah ini diawali dengan membuat gel zimogram menggunakan 12% acrylamide dan 5% gel. 

Setelah dibentuk, sebanyak 10 hingga 20 L sampel dimasukkan ke dalam masing -- masing well. Buffer yang digunakan dalam analisis menggunakan zimogram ini adalah 2-mercaptoethanol yang kemudian diproses menggunakan alat elektroforesis selama 1.5 hingga 2 jam pada kekuatan 100 Volt dan 50 Ampere. 

Setelah proses elektroforesis selesai, gel zimogram yang telah terbentuk direndam selama 30 menit dalam Triton X-100 kemudian dibilas menggunakan aquades. Dilanjutkan dengan merendam kembali gel pada buffer fosfat 50mM dengan pH 8 dan suhu 37oC. 

Pewarnaan pada gel memanfaatkan Coomassie Brilliant Blue (CBB) R-250 yang didiamkan selama 15 menit dan dilakukan destaining agar tervisualisasikan pita -- pita yang terbentuk dari sampel yang telah diinjeksi membentuk pita putih dengan latar berwarna biru (Johnson et al. 2015).

Enzim yang telah berhasil diekstraksi dan diidentifikasi menggunakan zimogram kemudian dapat dipurifikasi untuk mendapatkan enzim murni. 

Tahap purifikasi dimulai dengan memisahkan pelet dan supernatan dengan sentrifugasi selama 10 menit di suhu 40oC pada 12.000 g. Supernatan yang terbentuk kemudian difiltrasi menggunakan filter Sarsted 0.45 m dan disuspensi pada suhu 4oC overnight pada ammonium sulfate 80% w/v. 

Pelet yang terbentuk diresuspensi dengan buffer fosfat 50 mM yang memiliki pH 7.8 dan didialisis dengan buffer 20 volume selama 24 jam pada suhu 4oC. 

Masukkan sampel pada freeze dry dan diresuspensi kembali pada buffer fosfat pH 7.8 50 mM. Sampel dipisahkan dengan menggunakan Hitrap DEAE FF column yang diekuilibrasi dengan buffer fosfat 50 mM yang hasil elusinya akan keluar secara linear dari 0 hingga 1 M NaCl dengan laju alir 1 mL per menitnya (Johnson et al. 2015).