Metode Multiplex HPV Genotyping Kitadalah metode yang digunakan untuk mengetahui genotipe HPV. Multiplex HPV Genotyping Kitdapat medeteksi 24 genotipe HPV : HPV-6, HPV-11, HPV-16, HPV-18, HPV-26, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-42, HPV-43, HPV-44, HPV-45, HPV-51, HPV-52, HPV-53, HPV-56, HPV-58, HPV-59, HPV-66, HPV-68, HPV-70, HPV-73, dan HPV-82. Prinsip kerja Multiplex HPV Genotyping Kityaitu (1) ekstraksi sel untuk mengisolasi DNA, (2) DNA yang telah diisolasi kemudian di amplifikasi menggunakan PCR yang telah diberi label biotin pada primer sehingga DNA yang diperbanyakpun akan terlabel biotin. Biotin penting dalam proses deteksi hasil hibridisasi. Primer akan mengamplifikasi DNA β-globin manusia dan DNA ke-24 HPV, (3) hasil amplifikasi dihibridisasi menggunakan probespesifik dari ke-24 genotipe HPV, pada proses hibridisasi ini diperlukan sejumlah DNA untai tunggal, untuk mendenaturasi DNA untai ganda menjadi DNA untai tunggal pada metode ini menggunakan suhu tinggi sehingga DNA akan terdenaturasi, (4) kemudian proses deteksi menggunakan Luminex analyzersehingga produk PCR akan terdeteminasi oleh Phycoerythrin fluorescens (Novel dkk, 2011).
4. Metode DNA-HPV Micro Array
 Metode DNA-HPV Micro Arrayadalah metode yang digunakan untuk mengetahui genotipe HPV. DNA-HPV Micro Array dapat mendeteksi 24 genotipe HPV : HPV-6, HPV-11, HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-34, HPV-35, HPV-39, HPV-40, HPV-42, HPV-43, HPV-44, HPV-45, HPV-51, HPV-52, HPV-53, HPV-54, HPV-56, HPV-58, HPV-59, HPV-66, HPV-68, dan HPV-70. Prinsip kerja DNA-HPV Micro Array : (1) ekstraksi sel untuk mengisolasi DNA, (2) DNA yang telah diisolasi kemudian diamplifikasi menggunakan PCR, (3) hasil amplifikasi dihibridisasi menggunakan probe spesifik dari ke-24 genotipe HPV menggunakan sejumlah DNA untai tunggal, (4) kemudian proses deteksi sehingga akan terlihat genotipe-genotipe HPV pada sampel yang diperiksa.
Gambar 5. Hasil deteksi genotipe HPV.
5. Linear Array HPV Genotyping Test
Metode ini sudah digunakan pada banyak penelitian mengenai HPV, di RS Kanker Dharmais digunakan untuk diagnosis infeksi HPV penyebab kanker serviks dan kutil. Teknik ini adalah salah satu teknik terbaru di dunia molekuler untuk mendeteksi HPV. Kelebihan teknik ini adalah dapat diketahuinya tipe HPV yang menginfeksi, apakah tipe lr-HPV atau hr-HPV yang dapat menyebabkan kanker serviks. Linear Array HPV Genotyping Testmampu mendeteksi 37 genotipe HPV baik hr-HPV maupun lr-HPV secara bersamaan. Ke-37 genotipe HPV yaitu HPV-6, HPV-11, HPV-16, HPV-18, HPV-26, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-40, HPV-42, HPV-45, HPV-51, HPV-52, HPV-53, HPV-54, HPV-55, HPV-56, HPV-58, HPV-59, HPV-61, HPV-62, HPV-64, HPV-66, HPV-67, HPV-68, HPV-69, HPV-70, HPV-71, HPV-72, HPV-73, HPV-81, HPV-82, HPV-83, HPV-84, HPV-IS39, dan HPV-CP6108 (Van Hamont et al., 2006).
Gambar 6. Perangkat diagnostik Linear Array HPV Genotyping Test(1) PCR N9700, (2) reagen, (3) typing tray, dan (4) Linear Array HPV Genotyping Strip (Novel dkk., 2009a).
Prinsip kerja Linear Array HPV Genotyping Testterbagi menjadi 4 tahap. Tahap pertama ekstrasi DNA dari sampel menggunakan Amplilute Liquid Media Extration Kit, ekstraksi dimulai dengan melisis jaringan menggunakan buffer ATL, merusak protein dengan Proteinase K, merusak RNA dengan RNase sehingga akan diperoleh DNA yang diinginkan. Tahap kedua yaitu amplifikasi DNA menggunakan PCR TC9700. Prinsip dasar PCR pada metode Linear Array HPV Genotyping Testadalah enzim AmpliTaq GlodDNA polymerasememperbanyak sekuen spesifik yang dimulai dengan pelekatan primer dan menyatukan dNTP-dNTP yang berlangsung dalam reaksi termal (Novel dkk, 2009a).
Proses pra-denaturasi dan denaturasi DNA membutuhkan suhu 95oC, penempelan atau annealing membutuhkan suhu 55oC. Suhu 55oC adalah suhu hasil optimasi agar primer tidak salah menempel (mispriming). Proses elongasimembutuhkan waktu 1 menit dan suhu 72oC, hal tersebut sesuai dengan teori bahwa untai DNA tunggal yang disintesis oleh Taq polimerase membutuhkan suhu 72oC. Tahap ke tiga yaitu hibridisasi DNA, pada proses ini diperlukan sejumlah DNA untai tunggal sehingga DNA hasil amplifikasi harus didenaturasi menjadi DNA untai tunggal. Salah satu perlakuan untuk memecah ikatan hidrogen antar basa nitrogen adalah dengan penambahan senyawa alkali seperti NaOH yang terdapat pada larutan pendenaturasi. Hibridisasi asam nukleat mempunyai dua unsur utama yaitu DNA target dan pelacak. DNA target yaitu DNA yang telah terdenaturasi. Pelacak yang digunakan memiliki urutan spesifik untuk 37 genotipe HPV (Novel dkk., 2009a).
Gambar 7. Mekanisme hibridisasi dan deteksi pada metode LA HPV GT : (a) membran nilon pada strip, (b) pelacak yang berada di atas membran, (c) DNA hasil amplifikasi, (d) larutan hibridisasi, (e) DNA yang sudah terlabel biotin, (f) biotin label non radioaktif, (g) streptavidan yang berikatan dengan biotin dan horseradish-peroxidase, (h) H2O2 dan TMB (Van Hamont et al., 2006).
Pada tahap ke empat, prinsipnya DNA akan berikatan dengan pelacak yang menempel pada membran nilon bermuatan. DNA sudah diberi label biotin sehingga ikatan antara pelacak dan DNA akan terdeteksi dan menghasilkan sinyal. Sinyal tersebut akan ditangkap oleh streptavidin-horseradish peroxidasemenandakan bahwa ikatan pelacak dan DNA berhasil. Streptavidin-horseradish peroxidaseakan berikatan dengan H2O2 dan TMB (Tetramethylbenzine). Ikatan ini akan menghasilkan warna biru pada membran nilon yang menunjukkan genotipe HPV. Hasil deteksi akan terlihat berwarna biru di atas Linear Array HPV Genotyping Stripyang akan menunjukkan genotipe HPV sampel.
