Gambar 2. Alat PCR (Polymerase Chain Reaction)(Yuwono, 2006).
Prinsip kerja PCR dan elektroforesis yaitu (1) isolasi DNA sampel dari bahan klinis atau dari jaringan yang disimpan pada paraffin, (2) proses amplifikasi DNA yang telah diisolasi, proses amplifikasi sendiri terbagi tiga tahapan yaitu denaturasi, annealing, dan elongasi. Tahapan denaturasi terjadi pada suhu 97oC. Pada proses ini terjadi denaturasi linearisasi DNA. Tahap kedua adalah penempelan primer atau annealingpada DNA target yang akan diperbanyak, membutuhkan suhu sekitar 55oC. Tahap ketiga adalah elongasi (polimerisasi) membutuhkan suhu 72oC agar siklus polimerisasi lebih optimal, (3) hasil amplifikasi dideteksi menggunakan alat elektroforesis pada gel agarosa, teknik elektroforesis adalah teknik yang memisahkan molekul-molekul bentuk, muatan netto, dan berat molekulnya dalam sebuah medan listrik pada medium padat atau semipadat (Yuwono, 2006).
Gambar 3. Hasil amplifikasi yang dideteksi menggunakan PCR pada pemeriksaan HPV (Yuwono, 2006).
Metode PCR dan elektroforesis hanya digunakan untuk mendeteksi ada atau tidaknya DNA HPV di dalam sel epitel yang dicurigai terinfeksi HPV, sulit untuk menentukan genotipe HPV yang menginfeksi. Prosesgenotypingdengan metode PCR dan elektroforesis memerlukan waktu yang cukup lama, karena hanya menggunakan satu kontrol positif untuk satu genotipe HPV saja, umumnya HPV-16 atau HPV-18. Pada gambar 2 dapat dilihat nomor 1 sd.11, nomor 1 dan 2 merupakan kontrol negatif dan kontrol positif genotipe HPV-16. Nomor 3-11 adalah sampel-sampel yang positif terinfeksi, ke-9 sampel menunjukkan sinyal yang sama dengan nomor 2, menunjukkan bahwa ke-9 sampel tersebut positif terinfeksi HPV, namun tidak cukup untuk menentukan genotipe HPV dalam setiap sampelnya. Gambar 2. Hasil amplifikasi yang dideteksi menggunakan PCR pada pemeriksaan infeksi HPV.
2. Metode Hybrid Capture System(HC-II)
Hybrid Capture System(HC-II) adalah metode pemeriksaan hibridisasi dengan teknologi terbaru di bidang biologi molekuler. Teknik HC-II memeriksa pada kondisi lebih awal yaitu kemungkinan seseorang terinfeksi HPV sebelum virus tersebut membuat perubahan pada serviks yang akhirnya dapat mengakibatkan terjadinya kanker serviks. HC-II telah diakui dunia serta disahkan oleh FDA (Food and Drug Administration)Amerika Serikat (Castle et al,2002).
HC-II memiliki keakuratan yang tinggi dalam mendeteksi infeksi HPV karena mampu mendeteksi keberadaan DNA HPV dalam jumlah yang sangat kecil. Teknik HC-II adalah antibody capture / solution hybridization / signal amplication assayyang memakai deteksi kualitatif chemiluminescenceterhadap DNA HPV, secara umum HC-II ialah teknik berbasis DNA-RNA yang dapat mendeteksi secara akurat dan cepat dengan sensitivitas 98% dan spesifisitas HC-II 98% (Castle et al,2002).
Prinsip kerja HC-II yaitu menghancurkan protein kapsid virus HPV dalam sampel yang telah dimasukkan ke dalam botol sampel yang telah disediakan. Setelah kapsid dirusak, tahap berikutnya adalah mendenaturasi DNA untai ganda menjadi untai tunggal dengan menambahkan larutan denaturasi. Denaturasi merupakan langkah awal prosedur untuk mengeluarkan DNA (release DNA)target dari sel. Kemudian hibridisasi antara DNA virus dengan probeRNA menghasilkan DNA-RNA hybridyang ditangkap oleh antibodi yang kemudian akan bereaksi dengan antibodi kedua. Antibodi kedua ini bertindak sebagai sinyal amplifikasi, makin banyak hibrid DNA-RNA yang tertangkap pada dinding capture platemaka makin banyak pula antibodi kedua yang dapat mengenali hibrid DNA-RNA. Kuantitas antibodi yang terikat pada hibrid DNA-RNA diukur dengan menambahkan zat chemiluminescentsehingga menghasilkan sinyal chemiluminescent. Sinyal ini akan ditangkap oleh alat luminometer yang dihubungkan dengan komputer (Novel dkk., 2009b).
Gambar 4. Prinsip kerja HC-II (1) DNA yang sudah terdenaturasi, (2) hibridisasi DNA Virus dengan probeRNA, (3) hibrid DNA-RNA berikatan antibodi spesifik, (4) ikatan antibodi dengan hibrid DNA-RNA akan bereaksi dengan alkaline phosphatase, (5) reaksi ini menghasilkan sinyal chemiluminescent, (6) sinyal amplifikasi dalam bentuk emisi cahaya, diukur Luminometer, (7) pengukuran tersebut tersambung dengan perangkat komputer menghasilkan nilai RLU (Relative Light Unit)(Castle et al,2002).
Penentuan nilai positif uji DNA HPV didasarkan pada perbandingan sampel dengan rata-rata RLU/PV, jika perbandingan RLU/PC (relative light unit/posirif kontrol) melebihi nilai ambang positif maka spesimen dinyatakan positif terhadap tes DNA HPV[9]. Penentuan konsentrasi ambang DNA HPV yang akan berpeluang terbentuknya kanker leher rahim adalah sangat penting. Digenemenetapkan nilai ambang positif sebesar 1.0 RLU/PC[2,4,9]. Bila dibandingkan dengan PCR, HC-II memiliki ketepatan 92-94% terhadap teknik pemeriksaan sitologi/histologi, waktu yang lebih singkat, tidak terdapat atau hanya sedikit kontaminasi, dan disertai dengan probe. ProbeA untuk melacak DNA lr-HPV seperti HPV-6, HPV-11, HPV-42, HPV-43, dan HPV-44, sedangkan probe B untuk melacak 13 tipe DNA hr-HPV yaitu HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-52, HPV-56, HPV-58, HPV-59, dan HPV-68. Namun HC-II tidak dapat digunakan untuk menentukan genotipe HPV karena tes ini hanya memperkirakan secara kuantitatif jumlah virus tanpa mengetahui genotipe HPV-nya ( Novel dkk., 2009b).
3. Metode Multiplex HPV Genotyping Kit
