Virus Baru dari Genera Bacillus

REVIEW JURNAL

Applied Genetics And Molecular Biotechnology      “The Highly Modified Microcin Peptide Plantazolicin Is Associated With Nematicidal Activity Of Bacillus amyloliquefaciens FZB42”

Zhongzhong Liu & Anto Budiharjo & Pengfei Wang & Hui Shi & Juan Fang & Rainer Borriss & Keqin Zhang & Xiaowei Huang

Direview oleh Sukarman Hadi Jaya Putra  24020113410004

Dosen Pengampu: Dr. rer.nat. Anto Budiharjo, S.Si, M.Si.

PROGRAM MAGISTER BIOLOGI FAKULTAS SAINS DAN MATEMATIKA UNIVERSITAS DIPONEGORO 2014

ABSTRAK Bacillus amyloliquefaciens FZB42 telah terbukti dapat merangsang petumbuhan tanaman dan dapat menekan pertumbuhan pathogen seperti nematode. Namun, teori yang mendasari efeknya pada nematode baru sebagian kecilnya yang diketahui. Oleh karena itu, dari beberapa literature yang mendukung penelitian ini mendasari tentang keberadaan Bacillus amyloliquefaciens FZB42 yang didapatkan dari transposon TnYLB-1 dan hasil identifikasi strain mutan F5 yang telah dilemahkan kemampuan nematicidalnya. Dari hasil PCR menyatakan bahwa tiga gen kandidat yaitu; RAMB_007470, yhdY, dan prkA yang terganggu oleh transposon pada jalur F5 berpotensi memberikan kontribusi pada penurunan kemampuan nematocidal. Hasil bioassay mutan dari ketiga kandidat menunjjukkkan bahwa penghapusan pada RBAM_007470 mengakibatkan hilangnya kemampuan nematicidal yang sebanding dengan tiga mutan F5. RBAM_007470 juga terlibat dalam aktivitas biosintesis plantazolicin, yang dimodifikasi dengan menggunakan thiazole oxazole plantazolicin microcin. Hasil analisis menggunakan ESI-TOF-MS mengungkapkan bahwa plantazolicin pada bantalan berat molekul 1.354 Da memunculkan sifat liar dari Bacillus amyloliquefaciens FZB42, tapi tidak muncul pada mutan RABM_007470. Selain itu juga didukung oleh analisis bioassay yang mengandung organic plantazolicin yang menunjukkan tidak adanya kemampuan nematicidal. Oleh karena itu, dapat disimpulkan bahwa gen baru RABM _7470 dan metabolit terkait yang terlibat dalam efek anmtagonis yang diberikan Bacillus amyloliquefaciens FZB42 dapat menurunkan kemampuan nematocidal pada nematode.

a.    PENDAHULUAN

Nematode yang menjadi parasite pada tanaman merupakan faktor yang menyebakan kerugian terhadap produktivitas pertanian di seluruh dunia. Namun, metode pembasmian secara tradisional pada nematode tersebut sangat dibutuhkan supaya tidak menimbulkan permasalahan lingkungan. Salah satunya adalah penggunaan biocontrol pada nematode prasit tersebut telah mmberikan dampak yang signifikan dan memberikan hasil yang baik dan menjadi bahan penelitian menarik para peneliti (Duncan 1991;. Schneider et al 2003).  Oleh karena itu, beberapa agen biocopntrol telah sukses dikembangkan salah satunya adalah jamur nematofagus dan bakteri (Ahman 2000; Tikhonov et al. 2002; Tianetal. 2007). Beberapa jenis bakteri seperti seperti Pasteuria, Pseudomonas, Bacillus,  Actinomycetes, Agrobacterium, Arthrobacter, Alcaligenes,  Aureobacterium, Azotobacter, beijeranckii, Chromobacterium,  Clavibacter, Clostridium, Comamonas, Corynebacterium,  Curtobacterium, Desulfovibrio, Enterobacter, Flavobacterium,  Gluconobacter, Hydrogenophaga, Klebsiella, Methylobacterium, Phyllobacterium, Sphingobacterium, Rhizobium,  Stenotrophomonas, dan Variovorax, telah mempunyai potensi yang besar dapat mengendalikan infeksi yang diakibatkan nematoda (Tian et al. 2007). Tidak hanya itu, beberapa pathogen pada manusia seperti Burkholderia,  Serratia, Enterococcuss, Streptococcus, dan Staphylococcus,  juga telah dilaporkan memiliki efek tidak baik terhadap  nematoda (O'Quinn et al 2001; Kurz dan Ewbank 2000;  Garsin et al. 2001; Qin et al. 2000; Sifri et al. 2002). Penelitian menyatakan bahwa genus bakteri yang berbeda menggunakan metode yang berbeda pula dalam mekanisme patogenesisnya pada nematode. Contohnya adalah pada empat spesies Pasteuria yaitu Pasteuria ramosa, Pasteuria penetrans,  Pasteuria thornei, dan Pasteuria nishizawae yang berperan sebagai pemangsa nematode parasite pada akar Meloidogyne spp serta nematoda kista  Heterodera dan Globodera (Ebert et al 1996.;  Atibalentja et al. 2000). Selama pathogenesis, spora pasteuria yang pertama melekat pada kutikula, selanjutnya yang remaja berkecambah pada cacing yang ada dalam akar tanaman dan memangsa nematode tersebut. Bacillus thuringiensis menghasilkan protein kristal beracun dan enam protein Cry (CRY5, Cry6, Cry12, Cry13, Cry14,  dan Cry21) diketahui menjadi racun bagi larva, dan  beberapa hidup bebas pada nematode parasit (Bravo et al 1998; Marroquin et al, 2000;  Wei et al. 2003; Kotze et al. 2005). Setelah menelan racun oleh  target yaitu larva nematoda, kristal larut dalam usus dari  nematoda, diikuti dengan terbentuknya pori-pori litik dalam membran sel  dari sel epitel usus dan memunculkan aktivasi proteolitik  (Crickmore 2005;. Marroquin et al, 2000).  Tiga strain dalam tiga genera yang berbeda yaitu Pseudomonas fluorescens CHA0,  Laterosporus brevibacillus, dan Bacillus nematocida B16 mempunyai mekanisme patogensis yang sama-sama mengeluarkan virulen  protease pada ekstraseluler pada kutikula atau pencernaan  saluran, dan tanaman biokontrol nematoda parasit Meloidogyne  incognita dan Bursaphelenchus xylophiilus (Niu et al. 2006  2007; Huang et al. 2005). Nematode Pathogen pada manusia juga dapat dilumpuhkan menggunakan bakteri yakni, seperti Burkholderia  pseudomallei, Serratia marcescens, Enterococcus faecalis,  Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus dapat membunuh nematoda dengan mensekresi endotoksin neuromuskuler, cytolysin, dan  dua protease ekstraseluler (O'Quinn et al, 2001;. Kurzand  Ewbank 2000; Garsinetal. 2001; Qinetal. 2000; Sifri et al.  2002). Meskipun hasil besar telah dilakukan untuk memahami mekanisme yang mendasari patogenesis bakteri terhadap nematoda, hanya ada beberapa laporan tentang metabolit serta gen yang berhubungan dengan biosintesis mereka yang berkontribusi terhadap virulensi mereka. Bacillus amyloliquefaciens FZB42 adalah bakteri Gram positive dan dibedakan dari model organisme Bacillus subtilis oleh kemampuannya untuk merangsang pertumbuhan tanaman dan memangsa patogen yang ada pada akar tanaman  patogen seperti bakteri, jamur, dan bahkan nematoda akar-simpul. Berbagai metabolit sekunder yang dihasilkan oleh Bacillus amyloliquefaciens FZB42 telah disarankan untuk terlibat dalam kemampuan mengesankan untuk mengendalikan pathogen pada  tumbuhan dan untuk merangsang pertumbuhan tanaman.  Dalam tubuh  Bacillus amyloliquefaciens FZB42, terkandung metabolit sekita 340 kb, sesuai dengan 8,5% dari total  kapasitas genetik, yang dikhususkan untuk sintesis non-ribosom dari  metabolit sekunder termasuk poliketida antibakteri seperti bacillaene, difficidin, dan macrolactin dan  lipopeptides seperti surfactin,  fengycin, dan bacilomisin D, serta siderophores berupa bacillibactin Chen et al 2007). Namun, meskipun kemampuan yang jelas untuk mengurangi  telur nematoda di akar, cacing remaja dalam tanah, dan tanaman galls  pada tomat, gen-nematicide tertentu yang terkait serta mekanisme molekuler tetap perlu diketahui pada  B. amyloliquefaciens FZB42 (Burkett-Cadena et al. 2008). Oleh karena itu, pada penelitian ini, dengan dukungan beberapa literature dengan menggunakan mutan acak yakni Bacillus amyloliquefaciens FZB42 disiapkan dengan transposon pelaut  TnYLB-1 (Le Breton et al. 2006), gen RABM_007470,  yang terletak di cluster dari 12 gen yang meliputi 10 kb, adalah  terbukti terlibat dalam kemampuan membunuh nematoda. Karena cluster gen ini telah dijelaskan akan bertanggung jawab dalam proses biosintesis, modifikasi, ekspor, dan self-kekebalan plantazolicin, jenis baru dilaporkan athiazole /  microcin oxazole-dimodifikas_Tomn (Scholz et al. 2011), peneliti   selanjutnya membandingkan metabolit ekstraselular yang dibentuk oleh  ΔRABM_007470 mutan dan wild type galur. LC-TOF-MS assay menunjukkan bahwa komponen dengan berat molekul  dari 1354 Da [M + H + H2O]  +  tidak hadir karena gangguan  Gen RABM_007470, dan senyawa ini ditampilkan moderat  aktivitas nematicidal. Sebagai pengetahuan tambahan, laporan pertama pada  produk metabolik dan gen dikodekan dalam B. amyloliquefaciens  FZB42 yang berfungsi sebagai faktor patogenik terhadap nematoda. Hal ini menjadi langkah penting dalam memahami mekanisme aktivitas nematicidal dalam biocontrol.

b.    METODE PENELITIAN

Adapun mekanisme dalam penelitian ini adalah, antara lain:

1.    Strain bakteri  B. amyloliquefaciens dan Escherichia coli strain ditumbuhkan  pada suhu 37 ° C di Luria-Bertani broth menengah (LB) dengan dipadatkan menggunakan agar 2 %

2.    Penambahan antibiotic jika diperlukan dengan perlakuan yakni (ampisilin 100 mg / ml, kanamisin pada 25 mg / ml,  dan eritromisin pada 1 mg / ml).

3.    Penyediaan media tumbuh berupa 1354 Da dengan kandungan 40 g pepton kedelai, 40 g dekstrin, 1,8 g KH2PO4, 4,5 g K2HPO4, 0,3 g MgSO4 ⋅ 7H2O, dan  0,2 ml larutan Kelly jejak logam (25 mg EDTA [etilena- diamina-tetra acetic acid] disodium salt dihydrate, 0,5 g  ZnSO4 7H2O ⋅, 3.67CaCl2 ⋅ 2H2O, 1.25g FeCl2 ⋅ 4H2O,  0,25 g CoCl2 ⋅ 6H2O, 0,25 g amonium molibdat, 2,5 g  FeSO4 ⋅ 7H2O, dan 0,1 CuSO4 5H2O ⋅, 500 ml H2O) per liter (Scholz et al. 2011).

4.    Strain bakteri dan plasmid yang digunakan dalam penelitian ini adalah  tercantum dalam Tabel 1, dan reaksi berantai polimerase (PCR)  primer yang tercantum dalam Tabel 2.

Transposon library

Transposon berbasis TnYLB-1 plasmid digunakan untuk  menghasilkan daftar transposon menurut Haldenwang (Le  Breton et al. 2006; Dieteletal. 2013). Plasmid pMarA dan  pMarB berbeda dalam promotor yang mendorong ekspresi gen transposase Himar1. pMarA memiliki Himar1 bawah tran-control scriptional rumah tangga σ faktor σA dari B. subtilis,  sementara pMarB B menggunakan respon stres umum faktor σ σB untuk ekspresi transposase. Plasmid pMarC tidak memiliki transposase  gen serta promotor dan digunakan sebagai kontrol (Le  Breton et al. 2006). Secara singkat, plasmid pMarA, pMarB, dan  pMarC berubah menjadi B. amyloliquefaciens FZB42.  Sel kompeten B. amyloliquefaciens diperoleh dengan memodifikasi protokol dua langkah (Kunst dan Rapoport 1995)  menurut Idris et al. (2007). Transforman disaring  untuk properti plasmid terkait, yaitu Kanr  dan Ermr  di permis- suhu komprehensif untuk replikasi plasmid (30 ° C) dan Kanr  dan  Erms  pada suhu restriktif (48 ° C). Untuk memverifikasi bahwa ini  transforman mengandung plasmid utuh asli, plasmid  diekstraksi dari transforman dan berubah menjadi  E. coli DH5a. Selanjutnya, DNAwas plasmid diekstraksi dari E. coli  DH5a dan sasaran analisis restriksi endonuklease dengan  EcoRI. Pembatasan tersebut kemudian dianalisis melalui elektroforesis gel agarosa untuk memverifikasi bahwa transforman mengandung  plasmid yang benar. Untuk merangsang transposisi, klon terisolasi  ditumbuhkan semalam dalam medium LB cair pada suhu 37 ° C, dan kemudian  bagian dari setiap budaya yang berlapis di kedua LB, LB dan Kan  (5 mg / L), atau dan Erm (1 mg / L) dan diinkubasi pada non-permisif  suhu untuk replikasi plasmid (48 ° C) untuk memilih untuk  transposants seperti yang dijelaskan sebelumnya (Le Breton et al. 2006).  Bioassay pada aktivitas nematicidal  Kultur dan sinkronisasi nematoda yang  dilakukan sesuai dengan metode yang dimodifikasi dari laporan sebelumnya  (Brenner 1974; Lewis dan Fleming 1995). Secara singkat, setelah E. coli OP50, budaya semalam diunggulkan pada nematoda medium pertumbuhan (NGM) pelat agar [50 mM NaCl, 0,25% (b / v) pepton, 1 mM CaCl2, 5 kolesterol pg / ml, 25 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4, dan 1,7% (b / v) agar], strain Bristol N2 C. elegans (sekarang dari Kunming Animal Research Institute of Chinese Academy of Sciences) yang dibudidayakan untuk 2-3days  pada 20 ° C di halaman bakteri. Ketika cukup telur cacing (20-50/cm2) Yang diamati dengan mikroskop optik, mereka dicuci menggunakan 4 ml media M9 steril (5,8 g Na2HPO4 ⋅ 7H2O, 3 g KH2PO4, 5 g NaCl, 0.25 g MgSO4, 7H2O) dari NGM agar plate, diikuti dengan sering mencuci di M9 menengah untuk mengurangi Konsentrasi bakteri. Setelah menghapus supernatan cair,  pengobatan hipoklorit alkali dilakukan untuk mengisolasi  telur dengan 1-1,5 ml pemutih larutan lisis (5 M NaOH 0,3 ml,  8% NaClO1.2ml, ddH2O 3,5 ml). Telur dicuci  lagi dengan M9 menengah dan telur yang kemudian diinkubasi dalam 4-5 ml M9 mediuma t 22 ° C selama 18 jam untuk mendapatkan stage 1 larva nematoda (L1). Nematoda L1 ini kemudian ditransfer ke agar segar  NGM lempeng yang mengandung E. coli OP50 dan diinkubasi pada  22 ° C selama 2 sampai 3 hari sampai L4 panggung. Pada tahap ini nematoda  digunakan untuk bioassay.  Dalam bioassay ini peneliti mengukur aktivitas pembunuhan secara lambat dan cepat untuk mengetetahui kemampuan membunuh dari pada hewan uji yang digunakan (Garsin et al 2001;. Kurzetal.  2003; Garvis et al. 2009). Dalam uji pembunuhan lambat, 40-60 L4  C. elegans cacing ditambahkan ke piring berisi NGM  rumput bakteri yang akan diuji. Nematoda diinkubasi pada  25 ° C dan diperiksa setiap 24 jam selama 3-5 hari. Hasil essay pada cairan menunjukkan bahwa strain yang akan diuji adalah tumbuh  semalam pada suhu 37 ° C dengan 200 rpm gemetar 3 ml assay cair dengan Media (4.0 g NaCl, 2,5 g pepton, 5,0 g tryptone, 2,5 g ragi  ekstrak, 5 mg kolesterol, 7,5 ml gliserol, dH2Oto1liter). Lalu  masing-masing 100 ml kultur bakteri diencerkan dengan M9 media untuk  600 ml dan dipindahkan ke dalam 16 piring dengan baik. Setiap sumur unggulan  dengan 40-60 L4 tahap hermafrodit nematoda N2 dan  assay infeksi dilakukan pada 25 ° C selama 24 jam.  Dalam bioassay ini, nematoda dianggap mati  ketika ada gerakan yang diamati bawah mikroskop binokuler dan ketika penyadapan lembut nematoda oleh jarum  tidak menimbulkan respon apapun. Mortalitas nematoda yang  didefinisikan sebagai rasio nematoda mati atas diuji NEMA- todes. Semua percobaan dilakukan dalam tiga ulangan dan  diulang setidaknya tiga kali.

IPCR untuk Mengidentifikasi Gen

Virulensi Calon  Inverse PCR (IPCR) dilakukan sesuai dengan standar  prosedur (Le Breton et al. 2006) yakni sebagai berikut:  1.    Genomic Sampel DNA diisolasi dari mutan yang berasal dari transposon  mutagenesis yang pertama kali dicerna dengan enzim dan TaqI  maka DNA linear dicerna yang diedarkan di ligasi 2.    Melakukan pereaksian menggunakan T4 ligase (Takara, Dalian, Cina) pada DNA  konsentrasi 5 ng / ml. IPCR dilakukan dengan template dari 100 ng DNA diikat menggunakan primer dari oIPCR1 dan  oIPCR2, yang menghadap ke luar dari urutan transposon.  Produk IPCR dimurnikan menggunakan kit recovery (Biotek,  Beijing, Cina), dan produk tersebut kemudian dihubungkan diikat ke  plasmid PMD-18 T (Takara) dan sekuensing dengan PMD-18 T primer universal.

ESI-TOF-MS

Setelah strain bakteri yang diuji ditanam dalam produksi medium yang mengandung 1,5% agar pada suhu 37 ° C selama 24 jam, bakteri rumput dari empat lempeng pertumbuhan dikumpulkan ke dalam 50 ml tabung centrifuge dengan 30 ml campuran dari 70% asetonitril dan  30% air yang mengandung konsentrasi akhir 0,1% formiat  asam. Setelah vortexing menyeluruh dan kemudian sentrifugasi pada  8.000 rpm selama 20 menit, supernatan telah dihapus dan dimurnikan  dengan filter 0,45 um dan berturut-turut dikeringkan dengan rotary evaporator. Sampel dilarutkan dalam 2 ml campuran dari 90%  asam format dan 10% asetonitril untuk ionisasi elektrospray  waktu-of-penerbangan spektrometri massa (ESI-TOF-MS) analisis.  Analisis ESI-TOF-MS diterapkan di LC / TOF-MS dengan ESI  beroperasi dalam mode positif, dan dicapai dengan menggunakan sistem HPLC  (autosampler, dan pompa biner, Agilent Series 1100, Agilent  Technologies, Santa Clara, CA). Operasi berikut param- eters yang digunakan dalam analisis kami: fase gerak terdiri dari  pelarut A (60% air steril), pelarut B (20% asetonitril) dan  pelarut C (20% isopropil alkohol) pada aliran konstan 100 ml /  min; tegangan kapiler 3000 V; Tekanan nebulizer 40 psig; pengeringan  aliran gas 7 L / menit; suhu pengeringan gas 300 ° C; fragmentor  tegangan 210 V; tegangan skimmer 60 V. LC / TOF-MS akurat  spektrum massa tercatat di berbagai 50-3100 m / z. Pengolahan data dilakukan dengan Terapan Biosystems /  MDS-SCIEX QS Analyst perangkat lunak (Frankfurt, Jerman) dengan  massa akurat tambahan aplikasi khusus dari Agilent MSD  Software TOF (Valverde et al 2010; Arraez-Roman et al 2010).  Bioassay aktivitas nematicidal ke permukaan ekstraksi  Ekstraksi metabolit dari permukaan sel disusun dengan menggunakan metode yang sama dijelaskan di atas, kecuali bahwa  kering ekstraksi permukaan sel dilarutkan dalam metanol menghasilkan konsentrasi 40 mg /ml. Kemudian 20 μlliquorprepared di atas dicampur dengan 380 ml air steril dan ditambahkan ke dalam piring 16-baik, mencapai konsentrasi akhir permukaan sel  ekstraksi sebagai 2mg/ml.After penyemaian 40-60 L4 tahap hermaprodit nematoda N2 dalam setiap sumur, uji diinkubasi pada  25 ° C selama 24 jam. Campuran yang mengandung 5% metanol dan  95% air steril digunakan sebagai kontrol negatif.

c.    HASIL

Skrining perpustakaan transposon untuk mutan dilemahkan virulensi

Sebelum skrining perpustakaan mutagenesis transposon-penyisipan Bacillus amyloliquefaciens FZB42 diidentifikasi mutannya dengan dilemahkan menggunakan aktivitas nematicidal, mutan auksotrofik pertama kali diidentifikasi dan mutan ini dikeluarkan dari analisis lebih lanjut. Setelah  awal screening 400 mutan di perpustakaan, hanya 75% dari  mutan acak kemudian diuji untuk kegiatan nematicidal mereka. Akhirnya, uji kami mengidentifikasi 46 mutan yang menunjukkan penurunan virulensi dibandingkan dengan strain induk. Di antara mereka,  F5 strain mutan adalah salah satu calon. Dalam cairan cepat  membunuh assay, angka kematian kurang dari 10% diperoleh dalam waktu 4 jam dalam  Mutan F5 ketika 31,3 ± 4,7% nematoda dibunuh oleh  strain induk FZB42. Jika waktu infeksi diperpanjang sampai 16 jam,  53,2 kematian ± 2,6% diperoleh pada F5 sementara pengobatan mutan  kurang dari 10% nematoda selamat dalam pengobatan tipe liar  FZB42 (Gambar 1a).  Dalam uji pembunuhan lambat, nematoda diperlakukan  dengan mutan F5 memiliki kelangsungan hidup 10% lebih tinggi dari tipe liar  saring selama periode uji keseluruhan. Selain itu, F5 mutan dibutuhkan setidaknya satu hari tambahan untuk membunuh 50% dari terkena nematoda dalam uji ini (Gambar 1b). Dengan demikian, hasil di atas menunjukkan bahwa transposon penyisipan F5 mutan terdapat mutasi yang berdampak negatif terhadap aktivitas nematicidal nya.

Identifikasi Gen Kandidat Dalam Mutan F5

Mengambil DNA genomik TaqI-dicerna sebagai template, IPCR  dengan sepasang primer oIPCR1 dan oIPCR2 (Le Breton et al.  2006), yang dihadapi keluar dari urutan transposon, adalah  dilakukan untuk mengidentifikasi gen (s) terganggu dalam mutan F5. Setelah amplikon disekuensing, kami memilih fragmen DNA  yang berisi urutan parsial Tc1/himar1 mariner transposon vektor pada dua ujung terminal. Hal ini karena TnYLB-1 plasmid transposes dengan mekanisme 'cut-and-paste'  (Le Breton et al 2006; pada  Gambar 2b). Analisis peneliti menunjukkan bahwa tiga  gen dalam mutan F5 terganggu oleh transposon:  RBAM_007470, yhdY, dan prkA. RAMB_007470 terletak  dalam sebuah cluster 12 gen, sekitar 10 kb panjang, dan bahwa ini  klaster dikodekan protein docking / perancah dalam protein  kompleks untuk biosintesis senyawa Tomm (Garsin  et al. 2001; Gambar. 2a). Dua gen lain (yhdY dan prkA) yang  juga terganggu di F5 dan kedua gen masing-masing dikodekan  protein keluarga MSC uncharacterized yang mungkin berfungsi  dalam transportasi transmembran dan protein kinase serin (Earl  et al. 2012; Fischer et al. 1996)  Gangguan Gen RBAM_007470 disebabkan Dilemahkan Kegiatan Nematicidal Untuk menentukan mana dari tiga gen transposon-terganggu  mengakibatkan hilangnya virulensi dalam F5, peneliti mempekerjakan  vektor integrasi pMUTinNC untuk membangun plasmid bunuh diri  mengandung fragmen DNA internal dari tiga gen bermutasi  masing-masing dari tiga gen secara terpisah. Sebuah fragmen DNA internal  RBAM_007470 adalah PCR diamplifikasi. Amplikon dari 464 bp  dihubungkan ke pMD18-T, dibelah dengan HindIII dan BamHI,  dikloning ke pMUTinNC, dan menghasilkan plasmid rekombinan  PNC-007470 untuk gen lokus-diarahkan mutagenesis. itu  plasmid konstruk diperkenalkan ke B. amyloliquefaciens  FZB42 strain oleh chemotransformation.  Transformasi dan kromosom acara keberhasilan integrasi plasmid ke dalam  Gen RBAM_007470 dikonfirmasi dengan PCR melalui memperkuat knock-out target RBAM_007470 gen kita juga  sebagai knock-in gen anti-eritromisin. Dua mutagenesis locusdirected lain yhdY dan prkA dibangun dengan  metode yang sama (data tidak ditampilkan).  Setelah bioassaying tiga mutan tertentu dan kemudian membandingkan aktivitas nematicidal mereka ke induk galur wild type  FZB42 serta F5 mutan, kami menemukan bahwa gangguan  RBAM_007470 gen menyebabkan penurunan serupa nematicidal  kegiatan seperti yang dilakukan F5 mutan. Sebaliknya, tidak ada penurunan  Kegiatan nematocidal diamati untuk mutasi pada dua  gen lain yhdY dan prkA. Sebaliknya, mutan ΔRBAM_007470 dibunuh hanya 50,6 ± 3,3%  nematoda setelah 16 h dan butuh 28 jam untuk membunuh semua nematoda  (Gambar 1a). Dalam uji pembunuhan lambat, mutan ΔRBAM_007470  diperlukan setidaknya satu hari tambahan untuk membunuh 50% dari terkena  nematoda, mirip dengan yang ada pada F5 mutan.  Metabolit Plantazolicin Berfungsi Sebagai Faktor Virulensi  Cluster gen yang mengandung gen RABM_007470 telah  ditemukan penting untuk biosintesis plantazolicin (Scholz  et al. 2011). Dalam cluster ini, RABM_007470 gen adalah  diusulkan berfungsi sebagai protein docking / perancah di  kompleks protein yang terdiri dari cyclodehydratase (C), dehidrogenase (B), dan protein docking / perancah (D). Kami berhipotesis bahwa gangguan dari gen RABM_007470 menyebabkan penghapusan plantazolicin, yang kemudian menyebabkan  Kegiatan nematicidal dilemahkan di Bacillus amyloliquefaciens FZB42.  Untuk mengidentifikasi perbedaan metabolit mereka,  ekstrak permukaan dari Bacillus amyloliquefaciens FZB42 dan  ΔRABM_007470 mutan yang diuji oleh ESI-TOF-MS, masing masing. Senyawa ([M + H + H2O] +) dengan molekul  massa 1354 Da terdeteksi di alam liar-jenis strain tetapi  absen di mutan ΔRBAM_007470 (Gambar 3). Fitur  senyawa ini konsisten dengan plantazolicin dilaporkan sebelumnya (Scholz et al. 2011). Hasil penelitian menunjukkan  bahwa ΔRABM_007470 gen serta seluruh gen  cluster bertanggung jawab untuk biosintesis plantazolicin.    Gambar 3. ESI-TOF-MS detecting metabolites from organic extracts of B amyloliquefaciens FZB42 and ΔRBAM_007470 strains. (a)ESI- TOF-MS of cpd1354 [M+H] + from B. amyloliquefaciens FZB 42 in an m/zrangeof900to1600Da.(b) The corresponding metabolite cpd1354 [M+H] + could not be detected by ESI-TOF-MS in the ΔRBAM_007470 strain. Untuk lebih memastikan apakah penurunan aktivitas nematicidal  dihasilkan dari adanya plantazolicin, kami menentukan  virulensi metabolit ekstraseluler dari kedua tipe liar  saring dan theΔRABM_007470 mutan terhadap nematoda. Hasil penelitian menunjukkan bahwa tidak ada perbedaan yang jelas dalam kematian nematoda dalam awal 2 jam. Sampai dengan 24 jam, ekstraseluler  metabolit dari mutan ΔRABM_007470 menunjukkan virulensi 10-20% lebih rendah dibandingkan dengan wild type galur  (Gambar 4). Setelah 24 jam, kegiatan nematicidal menurun secara dramatis di kedua galur wild type dan ΔRABM_007470 yang  mutan, mungkin karena konsentrasi yang lebih rendah atau kehilangan aktivitas  metabolit permukaan. Dengan demikian, hasil kami di sini menunjukkan bahwa  produk metabolisme yang mengandung senyawa plantazolicin  memiliki aktivitas nematicidal lebih tinggi, menunjukkan virulensi potensial  faktor dalam B. amyloliquefaciens FZB42.   Fig. 4 Nematicidal activity of surface extracts of B. amyloliquefaciens FZB42 and ΔRBAM_007470 strains. 40–60 L4 stage C. elegans worms and 2mg/ml cell surface extractionwere seeded in 16well plates at 25 °C,  respectively. 5 % methanol and 95 % sterile water was used as negative control. The Y axis represents the percentage of nematode survival, and the X axis represents the time (in hours) after tests began.

d.    PEMBAHASAN

Ditetapkan perpustakaan mutan telah memungkinkan genom skala efisien  penyaringan dan menyediakan koleksi nyaman mutasi untuk  hampir semua gen yang tidak penting dari bunga (Cameron et al. 2008).  Di sisi lain, urutan genom dan terkait informasi penjelasan juga memfasilitasi generasi tinggi-throughput perpustakaan mutan yang komprehensif. Dengan demikian, pendekatan ini  telah berhasil digunakan untuk mengidentifikasi gen-virulensi terkait dalam  berbagai patogen terhadap nematoda seperti Pseudomonas  aeruginosa dan B. subtilis (Xia et al. 2011). Serupa dengan  dua kasus yang berhasil, di sini kami mengidentifikasi faktor-faktor nematotoxic  dan memperoleh wawasan ke dalam mekanisme patogenesis Bacillus amyloliquefaciens FZB42 menggunakan acak transposon-penyisipan  mutagenesis, di mana hampir semua ORFs di FZB42 yang  genome telah terganggu setidaknya sekali. Tidak termasuk pengaruh dari mutasi pada pertumbuhan terganggu dan  kelangsungan hidup, kami menemukan bahwa gangguan dari gen RBMA_007470 di  Bacillus amyloliquefaciens FZB42 penurunan aktivitas nematicidal di  kedua acak transposon-penyisipan F5 mutan dan ΔRABM_007470 mutan locus terdeteksi. Meskipun dua gen lainnya yhdY dan prkA juga terganggu dalam mutan F5, selanjutnya eksperimen untuk dua lokus-diarahkan mutagenesis regangan menunjukkan  kegiatan nematicidal mirip dengan tipe liar, menunjukkan tidak ada  kontribusi yang jelas dari kedua gen aktivitas nematotoxic.  RBAM_007470 (pznD) merupakan bagian dari cluster 12-gen (PZN  cluster) yang mencakup sekitar 10 kb dan terlibat dalam sintesis  plantazolicin (PZN). Telah dilaporkan bahwa cluster gen ini  adalah coding untuk PznA prepropeptide, dan PznBCD trimerik  kompleks protein (cyclodehydratase [C], dehidrogenase [B] dan  protein docking / perancah [D]) encoding posttranslational  modifikasi (Scholz et al. 2011). Struktur dari antibiotik peptida ribosomally disintesis, plantazolicin A dan B, telah baru-baru dijelaskan (Kalyon et al 2011;. Molohon et al. 2011). Karena genetik dan kimia konservasi struktur mereka, plantazolicin diklasifikasikan ke dalam kelompok Tomm dari  metabolit (Haft et al. 2010). Plantazolicin A dan desmethyl nya  plantazolicin analog B merupakan jenis yang tidak biasa thiazole /  oxazole mengandung antibiotik peptida (Tomm). Sebuah fitur struktural yang unik dari plantazolicin A adalah kedekatan dari dua  gugus pentaheterocyclic yang terutama memberi struktur planar  untuk peptida dan mengingatkan telomerase inhibitor  telomestatin (Shin-ya et al. 2001). Dalam sintesis plantazolicin  proses, trimerik "BCD" fungsi kompleks dalam dua berbeda  transformasi kimia. Yang pertama dikatalisis oleh  cyclodehydratase (C), yang mengubah Cys dan Ser / Thr residu  ke thiazoline sesuai dan (metil) oksazolin dengan  hilangnya air dari backbone amida. Dalam kedua,  dehydrogenase (B) menghilangkan dua elektron dan dua proton untuk  membayar thiazole aromatik dan (metil) oxazole (Li et al 1996.;  Milne et al. 1999). Protein docking perancah (D) tampaknya  memainkan peran dalam perakitan trimer dan regulasi enzimatik  aktivitas. Mekanisme ini juga sama digunakan dalam biosintesis yang  jalur untuk streptolisin S (Datta et al. 2005), dan B17 microcin (Li et al. 1996). Analisis kami sebelumnya mengungkapkan bahwa gangguan  salah satu anggota dari kompleks protein BCD mengarah ke hilangnya lengkap produksi plantazolicin di FZB42 (Scholz et al  2011). Di sini, kita menguatkan bahwa menemukan khusus untuk PznD: transposon penyisipan ke RBAM_007470 gen (pznD) ledtoa  kerugian lengkap dalam biosintesis plantazolicin. Saat ini, fungsi dari jenis produk alami memiliki  belum sepenuhnya dijelaskan belum. Streptolisin S disekresikan oleh  patogen manusia S. pyogenes adalah racun yang sangat cytolytic dan  memberikan kontribusi untuk fenotipe hemolitik bakteri ini.  Plantazolicin fromB. amyloliquefaciens FZB42 telah terbukti  sebagai spektrum sempit senyawa antibakteri (Molohon et al  2011). Hal ini dapat menghambat pertumbuhan terkait erat Gram-positif  bakteri, misalnya Bacillus anthracis, tetapi tidak menunjukkan aktivitas terhadap  Bakteri Gram negatif. Namun, kegiatan tersebut hanya  diamati ketika konsentrasi tinggi metabolit telah  diterapkan. Data yang disajikan di sini menjelaskan kegiatan untuk  memusuhi nematoda akar-simpul yang telah diamati sebelumnya (Burkett-Cadena et al. 2008) dan menunjukkan peran novel  plantazolicin dalam membunuh nematoda akar-simpul. Kegiatan seperti ini  dapat menyebabkan perkembangannya sebagai agen untuk pengendalian biologis.  Penelitian kami adalah laporan pertama yang menunjukkan bahwa plantazolicin  diproduksi oleh B. amyloliquefaciens FZB42 kontribusi untuk perusahaan  aktivitas nematicidal. Modus rinci tindakan plantazolicin  terhadap nematoda menunggu penyelidikan lebih lanjut, namun struktural  kesamaan dengan telomerase inhibitor telomestatin bisa berfungsi sebagai  pertama titik awal untuk penelitian lebih lanjut.