REVIEW JURNAL
Applied Genetics And Molecular Biotechnology “The Highly Modified Microcin Peptide Plantazolicin Is Associated With Nematicidal Activity Of Bacillus amyloliquefaciens FZB42”
Zhongzhong Liu & Anto Budiharjo & Pengfei Wang & Hui Shi & Juan Fang & Rainer Borriss & Keqin Zhang & Xiaowei Huang
Direview oleh Sukarman Hadi Jaya Putra 24020113410004
Dosen Pengampu: Dr. rer.nat. Anto Budiharjo, S.Si, M.Si.
PROGRAM MAGISTER BIOLOGI FAKULTAS SAINS DAN MATEMATIKA UNIVERSITAS DIPONEGORO 2014
ABSTRAK Bacillus amyloliquefaciens FZB42 telah terbukti dapat merangsang petumbuhan tanaman dan dapat menekan pertumbuhan pathogen seperti nematode. Namun, teori yang mendasari efeknya pada nematode baru sebagian kecilnya yang diketahui. Oleh karena itu, dari beberapa literature yang mendukung penelitian ini mendasari tentang keberadaan Bacillus amyloliquefaciens FZB42 yang didapatkan dari transposon TnYLB-1 dan hasil identifikasi strain mutan F5 yang telah dilemahkan kemampuan nematicidalnya. Dari hasil PCR menyatakan bahwa tiga gen kandidat yaitu; RAMB_007470, yhdY, dan prkA yang terganggu oleh transposon pada jalur F5 berpotensi memberikan kontribusi pada penurunan kemampuan nematocidal. Hasil bioassay mutan dari ketiga kandidat menunjjukkkan bahwa penghapusan pada RBAM_007470 mengakibatkan hilangnya kemampuan nematicidal yang sebanding dengan tiga mutan F5. RBAM_007470 juga terlibat dalam aktivitas biosintesis plantazolicin, yang dimodifikasi dengan menggunakan thiazole oxazole plantazolicin microcin. Hasil analisis menggunakan ESI-TOF-MS mengungkapkan bahwa plantazolicin pada bantalan berat molekul 1.354 Da memunculkan sifat liar dari Bacillus amyloliquefaciens FZB42, tapi tidak muncul pada mutan RABM_007470. Selain itu juga didukung oleh analisis bioassay yang mengandung organic plantazolicin yang menunjukkan tidak adanya kemampuan nematicidal. Oleh karena itu, dapat disimpulkan bahwa gen baru RABM _7470 dan metabolit terkait yang terlibat dalam efek anmtagonis yang diberikan Bacillus amyloliquefaciens FZB42 dapat menurunkan kemampuan nematocidal pada nematode.
a. PENDAHULUAN
Nematode yang menjadi parasite pada tanaman merupakan faktor yang menyebakan kerugian terhadap produktivitas pertanian di seluruh dunia. Namun, metode pembasmian secara tradisional pada nematode tersebut sangat dibutuhkan supaya tidak menimbulkan permasalahan lingkungan. Salah satunya adalah penggunaan biocontrol pada nematode prasit tersebut telah mmberikan dampak yang signifikan dan memberikan hasil yang baik dan menjadi bahan penelitian menarik para peneliti (Duncan 1991;. Schneider et al 2003). Oleh karena itu, beberapa agen biocopntrol telah sukses dikembangkan salah satunya adalah jamur nematofagus dan bakteri (Ahman 2000; Tikhonov et al. 2002; Tianetal. 2007). Beberapa jenis bakteri seperti seperti Pasteuria, Pseudomonas, Bacillus, Actinomycetes, Agrobacterium, Arthrobacter, Alcaligenes, Aureobacterium, Azotobacter, beijeranckii, Chromobacterium, Clavibacter, Clostridium, Comamonas, Corynebacterium, Curtobacterium, Desulfovibrio, Enterobacter, Flavobacterium, Gluconobacter, Hydrogenophaga, Klebsiella, Methylobacterium, Phyllobacterium, Sphingobacterium, Rhizobium, Stenotrophomonas, dan Variovorax, telah mempunyai potensi yang besar dapat mengendalikan infeksi yang diakibatkan nematoda (Tian et al. 2007). Tidak hanya itu, beberapa pathogen pada manusia seperti Burkholderia, Serratia, Enterococcuss, Streptococcus, dan Staphylococcus, juga telah dilaporkan memiliki efek tidak baik terhadap nematoda (O'Quinn et al 2001; Kurz dan Ewbank 2000; Garsin et al. 2001; Qin et al. 2000; Sifri et al. 2002). Penelitian menyatakan bahwa genus bakteri yang berbeda menggunakan metode yang berbeda pula dalam mekanisme patogenesisnya pada nematode. Contohnya adalah pada empat spesies Pasteuria yaitu Pasteuria ramosa, Pasteuria penetrans, Pasteuria thornei, dan Pasteuria nishizawae yang berperan sebagai pemangsa nematode parasite pada akar Meloidogyne spp serta nematoda kista Heterodera dan Globodera (Ebert et al 1996.; Atibalentja et al. 2000). Selama pathogenesis, spora pasteuria yang pertama melekat pada kutikula, selanjutnya yang remaja berkecambah pada cacing yang ada dalam akar tanaman dan memangsa nematode tersebut. Bacillus thuringiensis menghasilkan protein kristal beracun dan enam protein Cry (CRY5, Cry6, Cry12, Cry13, Cry14, dan Cry21) diketahui menjadi racun bagi larva, dan beberapa hidup bebas pada nematode parasit (Bravo et al 1998; Marroquin et al, 2000; Wei et al. 2003; Kotze et al. 2005). Setelah menelan racun oleh target yaitu larva nematoda, kristal larut dalam usus dari nematoda, diikuti dengan terbentuknya pori-pori litik dalam membran sel dari sel epitel usus dan memunculkan aktivasi proteolitik (Crickmore 2005;. Marroquin et al, 2000). Tiga strain dalam tiga genera yang berbeda yaitu Pseudomonas fluorescens CHA0, Laterosporus brevibacillus, dan Bacillus nematocida B16 mempunyai mekanisme patogensis yang sama-sama mengeluarkan virulen protease pada ekstraseluler pada kutikula atau pencernaan saluran, dan tanaman biokontrol nematoda parasit Meloidogyne incognita dan Bursaphelenchus xylophiilus (Niu et al. 2006 2007; Huang et al. 2005). Nematode Pathogen pada manusia juga dapat dilumpuhkan menggunakan bakteri yakni, seperti Burkholderia pseudomallei, Serratia marcescens, Enterococcus faecalis, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus dapat membunuh nematoda dengan mensekresi endotoksin neuromuskuler, cytolysin, dan dua protease ekstraseluler (O'Quinn et al, 2001;. Kurzand Ewbank 2000; Garsinetal. 2001; Qinetal. 2000; Sifri et al. 2002). Meskipun hasil besar telah dilakukan untuk memahami mekanisme yang mendasari patogenesis bakteri terhadap nematoda, hanya ada beberapa laporan tentang metabolit serta gen yang berhubungan dengan biosintesis mereka yang berkontribusi terhadap virulensi mereka. Bacillus amyloliquefaciens FZB42 adalah bakteri Gram positive dan dibedakan dari model organisme Bacillus subtilis oleh kemampuannya untuk merangsang pertumbuhan tanaman dan memangsa patogen yang ada pada akar tanaman patogen seperti bakteri, jamur, dan bahkan nematoda akar-simpul. Berbagai metabolit sekunder yang dihasilkan oleh Bacillus amyloliquefaciens FZB42 telah disarankan untuk terlibat dalam kemampuan mengesankan untuk mengendalikan pathogen pada tumbuhan dan untuk merangsang pertumbuhan tanaman. Dalam tubuh Bacillus amyloliquefaciens FZB42, terkandung metabolit sekita 340 kb, sesuai dengan 8,5% dari total kapasitas genetik, yang dikhususkan untuk sintesis non-ribosom dari metabolit sekunder termasuk poliketida antibakteri seperti bacillaene, difficidin, dan macrolactin dan lipopeptides seperti surfactin, fengycin, dan bacilomisin D, serta siderophores berupa bacillibactin Chen et al 2007). Namun, meskipun kemampuan yang jelas untuk mengurangi telur nematoda di akar, cacing remaja dalam tanah, dan tanaman galls pada tomat, gen-nematicide tertentu yang terkait serta mekanisme molekuler tetap perlu diketahui pada B. amyloliquefaciens FZB42 (Burkett-Cadena et al. 2008). Oleh karena itu, pada penelitian ini, dengan dukungan beberapa literature dengan menggunakan mutan acak yakni Bacillus amyloliquefaciens FZB42 disiapkan dengan transposon pelaut TnYLB-1 (Le Breton et al. 2006), gen RABM_007470, yang terletak di cluster dari 12 gen yang meliputi 10 kb, adalah terbukti terlibat dalam kemampuan membunuh nematoda. Karena cluster gen ini telah dijelaskan akan bertanggung jawab dalam proses biosintesis, modifikasi, ekspor, dan self-kekebalan plantazolicin, jenis baru dilaporkan athiazole / microcin oxazole-dimodifikas_Tomn (Scholz et al. 2011), peneliti selanjutnya membandingkan metabolit ekstraselular yang dibentuk oleh ΔRABM_007470 mutan dan wild type galur. LC-TOF-MS assay menunjukkan bahwa komponen dengan berat molekul dari 1354 Da [M + H + H2O] + tidak hadir karena gangguan Gen RABM_007470, dan senyawa ini ditampilkan moderat aktivitas nematicidal. Sebagai pengetahuan tambahan, laporan pertama pada produk metabolik dan gen dikodekan dalam B. amyloliquefaciens FZB42 yang berfungsi sebagai faktor patogenik terhadap nematoda. Hal ini menjadi langkah penting dalam memahami mekanisme aktivitas nematicidal dalam biocontrol.
b. METODE PENELITIAN
Adapun mekanisme dalam penelitian ini adalah, antara lain:
1. Strain bakteri B. amyloliquefaciens dan Escherichia coli strain ditumbuhkan pada suhu 37 ° C di Luria-Bertani broth menengah (LB) dengan dipadatkan menggunakan agar 2 %
2. Penambahan antibiotic jika diperlukan dengan perlakuan yakni (ampisilin 100 mg / ml, kanamisin pada 25 mg / ml, dan eritromisin pada 1 mg / ml).
3. Penyediaan media tumbuh berupa 1354 Da dengan kandungan 40 g pepton kedelai, 40 g dekstrin, 1,8 g KH2PO4, 4,5 g K2HPO4, 0,3 g MgSO4 ⋅ 7H2O, dan 0,2 ml larutan Kelly jejak logam (25 mg EDTA [etilena- diamina-tetra acetic acid] disodium salt dihydrate, 0,5 g ZnSO4 7H2O ⋅, 3.67CaCl2 ⋅ 2H2O, 1.25g FeCl2 ⋅ 4H2O, 0,25 g CoCl2 ⋅ 6H2O, 0,25 g amonium molibdat, 2,5 g FeSO4 ⋅ 7H2O, dan 0,1 CuSO4 5H2O ⋅, 500 ml H2O) per liter (Scholz et al. 2011).
4. Strain bakteri dan plasmid yang digunakan dalam penelitian ini adalah tercantum dalam Tabel 1, dan reaksi berantai polimerase (PCR) primer yang tercantum dalam Tabel 2.
Transposon library
Transposon berbasis TnYLB-1 plasmid digunakan untuk menghasilkan daftar transposon menurut Haldenwang (Le Breton et al. 2006; Dieteletal. 2013). Plasmid pMarA dan pMarB berbeda dalam promotor yang mendorong ekspresi gen transposase Himar1. pMarA memiliki Himar1 bawah tran-control scriptional rumah tangga σ faktor σA dari B. subtilis, sementara pMarB B menggunakan respon stres umum faktor σ σB untuk ekspresi transposase. Plasmid pMarC tidak memiliki transposase gen serta promotor dan digunakan sebagai kontrol (Le Breton et al. 2006). Secara singkat, plasmid pMarA, pMarB, dan pMarC berubah menjadi B. amyloliquefaciens FZB42. Sel kompeten B. amyloliquefaciens diperoleh dengan memodifikasi protokol dua langkah (Kunst dan Rapoport 1995) menurut Idris et al. (2007). Transforman disaring untuk properti plasmid terkait, yaitu Kanr dan Ermr di permis- suhu komprehensif untuk replikasi plasmid (30 ° C) dan Kanr dan Erms pada suhu restriktif (48 ° C). Untuk memverifikasi bahwa ini transforman mengandung plasmid utuh asli, plasmid diekstraksi dari transforman dan berubah menjadi E. coli DH5a. Selanjutnya, DNAwas plasmid diekstraksi dari E. coli DH5a dan sasaran analisis restriksi endonuklease dengan EcoRI. Pembatasan tersebut kemudian dianalisis melalui elektroforesis gel agarosa untuk memverifikasi bahwa transforman mengandung plasmid yang benar. Untuk merangsang transposisi, klon terisolasi ditumbuhkan semalam dalam medium LB cair pada suhu 37 ° C, dan kemudian bagian dari setiap budaya yang berlapis di kedua LB, LB dan Kan (5 mg / L), atau dan Erm (1 mg / L) dan diinkubasi pada non-permisif suhu untuk replikasi plasmid (48 ° C) untuk memilih untuk transposants seperti yang dijelaskan sebelumnya (Le Breton et al. 2006). Bioassay pada aktivitas nematicidal Kultur dan sinkronisasi nematoda yang dilakukan sesuai dengan metode yang dimodifikasi dari laporan sebelumnya (Brenner 1974; Lewis dan Fleming 1995). Secara singkat, setelah E. coli OP50, budaya semalam diunggulkan pada nematoda medium pertumbuhan (NGM) pelat agar [50 mM NaCl, 0,25% (b / v) pepton, 1 mM CaCl2, 5 kolesterol pg / ml, 25 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4, dan 1,7% (b / v) agar], strain Bristol N2 C. elegans (sekarang dari Kunming Animal Research Institute of Chinese Academy of Sciences) yang dibudidayakan untuk 2-3days pada 20 ° C di halaman bakteri. Ketika cukup telur cacing (20-50/cm2) Yang diamati dengan mikroskop optik, mereka dicuci menggunakan 4 ml media M9 steril (5,8 g Na2HPO4 ⋅ 7H2O, 3 g KH2PO4, 5 g NaCl, 0.25 g MgSO4, 7H2O) dari NGM agar plate, diikuti dengan sering mencuci di M9 menengah untuk mengurangi Konsentrasi bakteri. Setelah menghapus supernatan cair, pengobatan hipoklorit alkali dilakukan untuk mengisolasi telur dengan 1-1,5 ml pemutih larutan lisis (5 M NaOH 0,3 ml, 8% NaClO1.2ml, ddH2O 3,5 ml). Telur dicuci lagi dengan M9 menengah dan telur yang kemudian diinkubasi dalam 4-5 ml M9 mediuma t 22 ° C selama 18 jam untuk mendapatkan stage 1 larva nematoda (L1). Nematoda L1 ini kemudian ditransfer ke agar segar NGM lempeng yang mengandung E. coli OP50 dan diinkubasi pada 22 ° C selama 2 sampai 3 hari sampai L4 panggung. Pada tahap ini nematoda digunakan untuk bioassay. Dalam bioassay ini peneliti mengukur aktivitas pembunuhan secara lambat dan cepat untuk mengetetahui kemampuan membunuh dari pada hewan uji yang digunakan (Garsin et al 2001;. Kurzetal. 2003; Garvis et al. 2009). Dalam uji pembunuhan lambat, 40-60 L4 C. elegans cacing ditambahkan ke piring berisi NGM rumput bakteri yang akan diuji. Nematoda diinkubasi pada 25 ° C dan diperiksa setiap 24 jam selama 3-5 hari. Hasil essay pada cairan menunjukkan bahwa strain yang akan diuji adalah tumbuh semalam pada suhu 37 ° C dengan 200 rpm gemetar 3 ml assay cair dengan Media (4.0 g NaCl, 2,5 g pepton, 5,0 g tryptone, 2,5 g ragi ekstrak, 5 mg kolesterol, 7,5 ml gliserol, dH2Oto1liter). Lalu masing-masing 100 ml kultur bakteri diencerkan dengan M9 media untuk 600 ml dan dipindahkan ke dalam 16 piring dengan baik. Setiap sumur unggulan dengan 40-60 L4 tahap hermafrodit nematoda N2 dan assay infeksi dilakukan pada 25 ° C selama 24 jam. Dalam bioassay ini, nematoda dianggap mati ketika ada gerakan yang diamati bawah mikroskop binokuler dan ketika penyadapan lembut nematoda oleh jarum tidak menimbulkan respon apapun. Mortalitas nematoda yang didefinisikan sebagai rasio nematoda mati atas diuji NEMA- todes. Semua percobaan dilakukan dalam tiga ulangan dan diulang setidaknya tiga kali.
IPCR untuk Mengidentifikasi Gen
Virulensi Calon Inverse PCR (IPCR) dilakukan sesuai dengan standar prosedur (Le Breton et al. 2006) yakni sebagai berikut: 1. Genomic Sampel DNA diisolasi dari mutan yang berasal dari transposon mutagenesis yang pertama kali dicerna dengan enzim dan TaqI maka DNA linear dicerna yang diedarkan di ligasi 2. Melakukan pereaksian menggunakan T4 ligase (Takara, Dalian, Cina) pada DNA konsentrasi 5 ng / ml. IPCR dilakukan dengan template dari 100 ng DNA diikat menggunakan primer dari oIPCR1 dan oIPCR2, yang menghadap ke luar dari urutan transposon. Produk IPCR dimurnikan menggunakan kit recovery (Biotek, Beijing, Cina), dan produk tersebut kemudian dihubungkan diikat ke plasmid PMD-18 T (Takara) dan sekuensing dengan PMD-18 T primer universal.
ESI-TOF-MS
Setelah strain bakteri yang diuji ditanam dalam produksi medium yang mengandung 1,5% agar pada suhu 37 ° C selama 24 jam, bakteri rumput dari empat lempeng pertumbuhan dikumpulkan ke dalam 50 ml tabung centrifuge dengan 30 ml campuran dari 70% asetonitril dan 30% air yang mengandung konsentrasi akhir 0,1% formiat asam. Setelah vortexing menyeluruh dan kemudian sentrifugasi pada 8.000 rpm selama 20 menit, supernatan telah dihapus dan dimurnikan dengan filter 0,45 um dan berturut-turut dikeringkan dengan rotary evaporator. Sampel dilarutkan dalam 2 ml campuran dari 90% asam format dan 10% asetonitril untuk ionisasi elektrospray waktu-of-penerbangan spektrometri massa (ESI-TOF-MS) analisis. Analisis ESI-TOF-MS diterapkan di LC / TOF-MS dengan ESI beroperasi dalam mode positif, dan dicapai dengan menggunakan sistem HPLC (autosampler, dan pompa biner, Agilent Series 1100, Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Operasi berikut param- eters yang digunakan dalam analisis kami: fase gerak terdiri dari pelarut A (60% air steril), pelarut B (20% asetonitril) dan pelarut C (20% isopropil alkohol) pada aliran konstan 100 ml / min; tegangan kapiler 3000 V; Tekanan nebulizer 40 psig; pengeringan aliran gas 7 L / menit; suhu pengeringan gas 300 ° C; fragmentor tegangan 210 V; tegangan skimmer 60 V. LC / TOF-MS akurat spektrum massa tercatat di berbagai 50-3100 m / z. Pengolahan data dilakukan dengan Terapan Biosystems / MDS-SCIEX QS Analyst perangkat lunak (Frankfurt, Jerman) dengan massa akurat tambahan aplikasi khusus dari Agilent MSD Software TOF (Valverde et al 2010; Arraez-Roman et al 2010). Bioassay aktivitas nematicidal ke permukaan ekstraksi Ekstraksi metabolit dari permukaan sel disusun dengan menggunakan metode yang sama dijelaskan di atas, kecuali bahwa kering ekstraksi permukaan sel dilarutkan dalam metanol menghasilkan konsentrasi 40 mg /ml. Kemudian 20 μlliquorprepared di atas dicampur dengan 380 ml air steril dan ditambahkan ke dalam piring 16-baik, mencapai konsentrasi akhir permukaan sel ekstraksi sebagai 2mg/ml.After penyemaian 40-60 L4 tahap hermaprodit nematoda N2 dalam setiap sumur, uji diinkubasi pada 25 ° C selama 24 jam. Campuran yang mengandung 5% metanol dan 95% air steril digunakan sebagai kontrol negatif.
c. HASIL
Skrining perpustakaan transposon untuk mutan dilemahkan virulensi
Sebelum skrining perpustakaan mutagenesis transposon-penyisipan Bacillus amyloliquefaciens FZB42 diidentifikasi mutannya dengan dilemahkan menggunakan aktivitas nematicidal, mutan auksotrofik pertama kali diidentifikasi dan mutan ini dikeluarkan dari analisis lebih lanjut. Setelah awal screening 400 mutan di perpustakaan, hanya 75% dari mutan acak kemudian diuji untuk kegiatan nematicidal mereka. Akhirnya, uji kami mengidentifikasi 46 mutan yang menunjukkan penurunan virulensi dibandingkan dengan strain induk. Di antara mereka, F5 strain mutan adalah salah satu calon. Dalam cairan cepat membunuh assay, angka kematian kurang dari 10% diperoleh dalam waktu 4 jam dalam Mutan F5 ketika 31,3 ± 4,7% nematoda dibunuh oleh strain induk FZB42. Jika waktu infeksi diperpanjang sampai 16 jam, 53,2 kematian ± 2,6% diperoleh pada F5 sementara pengobatan mutan kurang dari 10% nematoda selamat dalam pengobatan tipe liar FZB42 (Gambar 1a). Dalam uji pembunuhan lambat, nematoda diperlakukan dengan mutan F5 memiliki kelangsungan hidup 10% lebih tinggi dari tipe liar saring selama periode uji keseluruhan. Selain itu, F5 mutan dibutuhkan setidaknya satu hari tambahan untuk membunuh 50% dari terkena nematoda dalam uji ini (Gambar 1b). Dengan demikian, hasil di atas menunjukkan bahwa transposon penyisipan F5 mutan terdapat mutasi yang berdampak negatif terhadap aktivitas nematicidal nya.
Identifikasi Gen Kandidat Dalam Mutan F5
Mengambil DNA genomik TaqI-dicerna sebagai template, IPCR dengan sepasang primer oIPCR1 dan oIPCR2 (Le Breton et al. 2006), yang dihadapi keluar dari urutan transposon, adalah dilakukan untuk mengidentifikasi gen (s) terganggu dalam mutan F5. Setelah amplikon disekuensing, kami memilih fragmen DNA yang berisi urutan parsial Tc1/himar1 mariner transposon vektor pada dua ujung terminal. Hal ini karena TnYLB-1 plasmid transposes dengan mekanisme 'cut-and-paste' (Le Breton et al 2006; pada Gambar 2b). Analisis peneliti menunjukkan bahwa tiga gen dalam mutan F5 terganggu oleh transposon: RBAM_007470, yhdY, dan prkA. RAMB_007470 terletak dalam sebuah cluster 12 gen, sekitar 10 kb panjang, dan bahwa ini klaster dikodekan protein docking / perancah dalam protein kompleks untuk biosintesis senyawa Tomm (Garsin et al. 2001; Gambar. 2a). Dua gen lain (yhdY dan prkA) yang juga terganggu di F5 dan kedua gen masing-masing dikodekan protein keluarga MSC uncharacterized yang mungkin berfungsi dalam transportasi transmembran dan protein kinase serin (Earl et al. 2012; Fischer et al. 1996) Gangguan Gen RBAM_007470 disebabkan Dilemahkan Kegiatan Nematicidal Untuk menentukan mana dari tiga gen transposon-terganggu mengakibatkan hilangnya virulensi dalam F5, peneliti mempekerjakan vektor integrasi pMUTinNC untuk membangun plasmid bunuh diri mengandung fragmen DNA internal dari tiga gen bermutasi masing-masing dari tiga gen secara terpisah. Sebuah fragmen DNA internal RBAM_007470 adalah PCR diamplifikasi. Amplikon dari 464 bp dihubungkan ke pMD18-T, dibelah dengan HindIII dan BamHI, dikloning ke pMUTinNC, dan menghasilkan plasmid rekombinan PNC-007470 untuk gen lokus-diarahkan mutagenesis. itu plasmid konstruk diperkenalkan ke B. amyloliquefaciens FZB42 strain oleh chemotransformation. Transformasi dan kromosom acara keberhasilan integrasi plasmid ke dalam Gen RBAM_007470 dikonfirmasi dengan PCR melalui memperkuat knock-out target RBAM_007470 gen kita juga sebagai knock-in gen anti-eritromisin. Dua mutagenesis locusdirected lain yhdY dan prkA dibangun dengan metode yang sama (data tidak ditampilkan). Setelah bioassaying tiga mutan tertentu dan kemudian membandingkan aktivitas nematicidal mereka ke induk galur wild type FZB42 serta F5 mutan, kami menemukan bahwa gangguan RBAM_007470 gen menyebabkan penurunan serupa nematicidal kegiatan seperti yang dilakukan F5 mutan. Sebaliknya, tidak ada penurunan Kegiatan nematocidal diamati untuk mutasi pada dua gen lain yhdY dan prkA. Sebaliknya, mutan ΔRBAM_007470 dibunuh hanya 50,6 ± 3,3% nematoda setelah 16 h dan butuh 28 jam untuk membunuh semua nematoda (Gambar 1a). Dalam uji pembunuhan lambat, mutan ΔRBAM_007470 diperlukan setidaknya satu hari tambahan untuk membunuh 50% dari terkena nematoda, mirip dengan yang ada pada F5 mutan. Metabolit Plantazolicin Berfungsi Sebagai Faktor Virulensi Cluster gen yang mengandung gen RABM_007470 telah ditemukan penting untuk biosintesis plantazolicin (Scholz et al. 2011). Dalam cluster ini, RABM_007470 gen adalah diusulkan berfungsi sebagai protein docking / perancah di kompleks protein yang terdiri dari cyclodehydratase (C), dehidrogenase (B), dan protein docking / perancah (D). Kami berhipotesis bahwa gangguan dari gen RABM_007470 menyebabkan penghapusan plantazolicin, yang kemudian menyebabkan Kegiatan nematicidal dilemahkan di Bacillus amyloliquefaciens FZB42. Untuk mengidentifikasi perbedaan metabolit mereka, ekstrak permukaan dari Bacillus amyloliquefaciens FZB42 dan ΔRABM_007470 mutan yang diuji oleh ESI-TOF-MS, masing masing. Senyawa ([M + H + H2O] +) dengan molekul massa 1354 Da terdeteksi di alam liar-jenis strain tetapi absen di mutan ΔRBAM_007470 (Gambar 3). Fitur senyawa ini konsisten dengan plantazolicin dilaporkan sebelumnya (Scholz et al. 2011). Hasil penelitian menunjukkan bahwa ΔRABM_007470 gen serta seluruh gen cluster bertanggung jawab untuk biosintesis plantazolicin. Gambar 3. ESI-TOF-MS detecting metabolites from organic extracts of B amyloliquefaciens FZB42 and ΔRBAM_007470 strains. (a)ESI- TOF-MS of cpd1354 [M+H] + from B. amyloliquefaciens FZB 42 in an m/zrangeof900to1600Da.(b) The corresponding metabolite cpd1354 [M+H] + could not be detected by ESI-TOF-MS in the ΔRBAM_007470 strain. Untuk lebih memastikan apakah penurunan aktivitas nematicidal dihasilkan dari adanya plantazolicin, kami menentukan virulensi metabolit ekstraseluler dari kedua tipe liar saring dan theΔRABM_007470 mutan terhadap nematoda. Hasil penelitian menunjukkan bahwa tidak ada perbedaan yang jelas dalam kematian nematoda dalam awal 2 jam. Sampai dengan 24 jam, ekstraseluler metabolit dari mutan ΔRABM_007470 menunjukkan virulensi 10-20% lebih rendah dibandingkan dengan wild type galur (Gambar 4). Setelah 24 jam, kegiatan nematicidal menurun secara dramatis di kedua galur wild type dan ΔRABM_007470 yang mutan, mungkin karena konsentrasi yang lebih rendah atau kehilangan aktivitas metabolit permukaan. Dengan demikian, hasil kami di sini menunjukkan bahwa produk metabolisme yang mengandung senyawa plantazolicin memiliki aktivitas nematicidal lebih tinggi, menunjukkan virulensi potensial faktor dalam B. amyloliquefaciens FZB42. Fig. 4 Nematicidal activity of surface extracts of B. amyloliquefaciens FZB42 and ΔRBAM_007470 strains. 40–60 L4 stage C. elegans worms and 2mg/ml cell surface extractionwere seeded in 16well plates at 25 °C, respectively. 5 % methanol and 95 % sterile water was used as negative control. The Y axis represents the percentage of nematode survival, and the X axis represents the time (in hours) after tests began.
d. PEMBAHASAN
Ditetapkan perpustakaan mutan telah memungkinkan genom skala efisien penyaringan dan menyediakan koleksi nyaman mutasi untuk hampir semua gen yang tidak penting dari bunga (Cameron et al. 2008). Di sisi lain, urutan genom dan terkait informasi penjelasan juga memfasilitasi generasi tinggi-throughput perpustakaan mutan yang komprehensif. Dengan demikian, pendekatan ini telah berhasil digunakan untuk mengidentifikasi gen-virulensi terkait dalam berbagai patogen terhadap nematoda seperti Pseudomonas aeruginosa dan B. subtilis (Xia et al. 2011). Serupa dengan dua kasus yang berhasil, di sini kami mengidentifikasi faktor-faktor nematotoxic dan memperoleh wawasan ke dalam mekanisme patogenesis Bacillus amyloliquefaciens FZB42 menggunakan acak transposon-penyisipan mutagenesis, di mana hampir semua ORFs di FZB42 yang genome telah terganggu setidaknya sekali. Tidak termasuk pengaruh dari mutasi pada pertumbuhan terganggu dan kelangsungan hidup, kami menemukan bahwa gangguan dari gen RBMA_007470 di Bacillus amyloliquefaciens FZB42 penurunan aktivitas nematicidal di kedua acak transposon-penyisipan F5 mutan dan ΔRABM_007470 mutan locus terdeteksi. Meskipun dua gen lainnya yhdY dan prkA juga terganggu dalam mutan F5, selanjutnya eksperimen untuk dua lokus-diarahkan mutagenesis regangan menunjukkan kegiatan nematicidal mirip dengan tipe liar, menunjukkan tidak ada kontribusi yang jelas dari kedua gen aktivitas nematotoxic. RBAM_007470 (pznD) merupakan bagian dari cluster 12-gen (PZN cluster) yang mencakup sekitar 10 kb dan terlibat dalam sintesis plantazolicin (PZN). Telah dilaporkan bahwa cluster gen ini adalah coding untuk PznA prepropeptide, dan PznBCD trimerik kompleks protein (cyclodehydratase [C], dehidrogenase [B] dan protein docking / perancah [D]) encoding posttranslational modifikasi (Scholz et al. 2011). Struktur dari antibiotik peptida ribosomally disintesis, plantazolicin A dan B, telah baru-baru dijelaskan (Kalyon et al 2011;. Molohon et al. 2011). Karena genetik dan kimia konservasi struktur mereka, plantazolicin diklasifikasikan ke dalam kelompok Tomm dari metabolit (Haft et al. 2010). Plantazolicin A dan desmethyl nya plantazolicin analog B merupakan jenis yang tidak biasa thiazole / oxazole mengandung antibiotik peptida (Tomm). Sebuah fitur struktural yang unik dari plantazolicin A adalah kedekatan dari dua gugus pentaheterocyclic yang terutama memberi struktur planar untuk peptida dan mengingatkan telomerase inhibitor telomestatin (Shin-ya et al. 2001). Dalam sintesis plantazolicin proses, trimerik "BCD" fungsi kompleks dalam dua berbeda transformasi kimia. Yang pertama dikatalisis oleh cyclodehydratase (C), yang mengubah Cys dan Ser / Thr residu ke thiazoline sesuai dan (metil) oksazolin dengan hilangnya air dari backbone amida. Dalam kedua, dehydrogenase (B) menghilangkan dua elektron dan dua proton untuk membayar thiazole aromatik dan (metil) oxazole (Li et al 1996.; Milne et al. 1999). Protein docking perancah (D) tampaknya memainkan peran dalam perakitan trimer dan regulasi enzimatik aktivitas. Mekanisme ini juga sama digunakan dalam biosintesis yang jalur untuk streptolisin S (Datta et al. 2005), dan B17 microcin (Li et al. 1996). Analisis kami sebelumnya mengungkapkan bahwa gangguan salah satu anggota dari kompleks protein BCD mengarah ke hilangnya lengkap produksi plantazolicin di FZB42 (Scholz et al 2011). Di sini, kita menguatkan bahwa menemukan khusus untuk PznD: transposon penyisipan ke RBAM_007470 gen (pznD) ledtoa kerugian lengkap dalam biosintesis plantazolicin. Saat ini, fungsi dari jenis produk alami memiliki belum sepenuhnya dijelaskan belum. Streptolisin S disekresikan oleh patogen manusia S. pyogenes adalah racun yang sangat cytolytic dan memberikan kontribusi untuk fenotipe hemolitik bakteri ini. Plantazolicin fromB. amyloliquefaciens FZB42 telah terbukti sebagai spektrum sempit senyawa antibakteri (Molohon et al 2011). Hal ini dapat menghambat pertumbuhan terkait erat Gram-positif bakteri, misalnya Bacillus anthracis, tetapi tidak menunjukkan aktivitas terhadap Bakteri Gram negatif. Namun, kegiatan tersebut hanya diamati ketika konsentrasi tinggi metabolit telah diterapkan. Data yang disajikan di sini menjelaskan kegiatan untuk memusuhi nematoda akar-simpul yang telah diamati sebelumnya (Burkett-Cadena et al. 2008) dan menunjukkan peran novel plantazolicin dalam membunuh nematoda akar-simpul. Kegiatan seperti ini dapat menyebabkan perkembangannya sebagai agen untuk pengendalian biologis. Penelitian kami adalah laporan pertama yang menunjukkan bahwa plantazolicin diproduksi oleh B. amyloliquefaciens FZB42 kontribusi untuk perusahaan aktivitas nematicidal. Modus rinci tindakan plantazolicin terhadap nematoda menunggu penyelidikan lebih lanjut, namun struktural kesamaan dengan telomerase inhibitor telomestatin bisa berfungsi sebagai pertama titik awal untuk penelitian lebih lanjut.
