1.   Strain bakteri B. amyloliquefaciens dan Escherichia coli strain ditumbuhkan pada suhu 37 ° C di Luria-Bertani broth menengah (LB) dengan dipadatkan menggunakan agar 2 %
2.   Penambahan antibiotic jika diperlukan dengan perlakuan yakni (ampisilin 100 mg / ml, kanamisin pada 25 mg / ml, dan eritromisin pada 1 mg / ml).
3.   Penyediaan media tumbuh berupa 1354 Da dengan kandungan 40 g pepton kedelai, 40 g dekstrin, 1,8 g KH2PO4, 4,5 g K2HPO4, 0,3 g MgSO4 ⋅ 7H2O, dan 0,2 ml larutan Kelly jejak logam (25 mg EDTA [etilena- diamina-tetra acetic acid] disodium salt dihydrate, 0,5 g ZnSO4 7H2O ⋅, 3.67CaCl2 ⋅ 2H2O, 1.25g FeCl2 ⋅ 4H2O, 0,25 g CoCl2 ⋅ 6H2O, 0,25 g amonium molibdat, 2,5 g FeSO4 ⋅ 7H2O, dan 0,1 CuSO4 5H2O ⋅, 500 ml H2O) per liter (Scholz et al. 2011).
4.   Strain bakteri dan plasmid yang digunakan dalam penelitian ini adalah tercantum dalam Tabel 1, dan reaksi berantai polimerase (PCR) primer yang tercantum dalam Tabel 2.
Transposon library
Transposon berbasis TnYLB-1 plasmid digunakan untuk menghasilkan daftar transposon menurut Haldenwang (Le Breton et al. 2006; Dieteletal. 2013). Plasmid pMarA dan pMarB berbeda dalam promotor yang mendorong ekspresi gen transposase Himar1. pMarA memiliki Himar1 bawah tran-control scriptional rumah tangga σ faktor σA dari B. subtilis, sementara pMarB B menggunakan respon stres umum faktor σ σB untuk ekspresi transposase. Plasmid pMarC tidak memiliki transposase gen serta promotor dan digunakan sebagai kontrol (Le Breton et al. 2006). Secara singkat, plasmid pMarA, pMarB, dan pMarC berubah menjadi B. amyloliquefaciens FZB42. Sel kompeten B. amyloliquefaciens diperoleh dengan memodifikasi protokol dua langkah (Kunst dan Rapoport 1995) menurut Idris et al. (2007). Transforman disaring untuk properti plasmid terkait, yaitu Kanr dan Ermr di permis- suhu komprehensif untuk replikasi plasmid (30 ° C) dan Kanr dan Erms pada suhu restriktif (48 ° C). Untuk memverifikasi bahwa ini transforman mengandung plasmid utuh asli, plasmid diekstraksi dari transforman dan berubah menjadi E. coli DH5a. Selanjutnya, DNAwas plasmid diekstraksi dari E. coli DH5a dan sasaran analisis restriksi endonuklease dengan EcoRI. Pembatasan tersebut kemudian dianalisis melalui elektroforesis gel agarosa untuk memverifikasi bahwa transforman mengandung plasmid yang benar. Untuk merangsang transposisi, klon terisolasi ditumbuhkan semalam dalam medium LB cair pada suhu 37 ° C, dan kemudian bagian dari setiap budaya yang berlapis di kedua LB, LB dan Kan (5 mg / L), atau dan Erm (1 mg / L) dan diinkubasi pada non-permisif suhu untuk replikasi plasmid (48 ° C) untuk memilih untuk transposants seperti yang dijelaskan sebelumnya (Le Breton et al. 2006). Bioassay pada aktivitas nematicidal Kultur dan sinkronisasi nematoda yang dilakukan sesuai dengan metode yang dimodifikasi dari laporan sebelumnya (Brenner 1974; Lewis dan Fleming 1995). Secara singkat, setelah E. coli OP50, budaya semalam diunggulkan pada nematoda medium pertumbuhan (NGM) pelat agar [50 mM NaCl, 0,25% (b / v) pepton, 1 mM CaCl2, 5 kolesterol pg / ml, 25 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4, dan 1,7% (b / v) agar], strain Bristol N2 C. elegans (sekarang dari Kunming Animal Research Institute of Chinese Academy of Sciences) yang dibudidayakan untuk 2-3days pada 20 ° C di halaman bakteri. Ketika cukup telur cacing (20-50/cm2) Yang diamati dengan mikroskop optik, mereka dicuci menggunakan 4 ml media M9 steril (5,8 g Na2HPO4 ⋅ 7H2O, 3 g KH2PO4, 5 g NaCl, 0.25 g MgSO4, 7H2O) dari NGM agar plate, diikuti dengan sering mencuci di M9 menengah untuk mengurangi Konsentrasi bakteri. Setelah menghapus supernatan cair, pengobatan hipoklorit alkali dilakukan untuk mengisolasi telur dengan 1-1,5 ml pemutih larutan lisis (5 M NaOH 0,3 ml, 8% NaClO1.2ml, ddH2O 3,5 ml). Telur dicuci lagi dengan M9 menengah dan telur yang kemudian diinkubasi dalam 4-5 ml M9 mediuma t 22 ° C selama 18 jam untuk mendapatkan stage 1 larva nematoda (L1). Nematoda L1 ini kemudian ditransfer ke agar segar NGM lempeng yang mengandung E. coli OP50 dan diinkubasi pada 22 ° C selama 2 sampai 3 hari sampai L4 panggung. Pada tahap ini nematoda digunakan untuk bioassay. Dalam bioassay ini peneliti mengukur aktivitas pembunuhan secara lambat dan cepat untuk mengetetahui kemampuan membunuh dari pada hewan uji yang digunakan (Garsin et al 2001;. Kurzetal. 2003; Garvis et al. 2009). Dalam uji pembunuhan lambat, 40-60 L4 C. elegans cacing ditambahkan ke piring berisi NGM rumput bakteri yang akan diuji. Nematoda diinkubasi pada 25 ° C dan diperiksa setiap 24 jam selama 3-5 hari. Hasil essay pada cairan menunjukkan bahwa strain yang akan diuji adalah tumbuh semalam pada suhu 37 ° C dengan 200 rpm gemetar 3 ml assay cair dengan Media (4.0 g NaCl, 2,5 g pepton, 5,0 g tryptone, 2,5 g ragi ekstrak, 5 mg kolesterol, 7,5 ml gliserol, dH2Oto1liter). Lalu masing-masing 100 ml kultur bakteri diencerkan dengan M9 media untuk 600 ml dan dipindahkan ke dalam 16 piring dengan baik. Setiap sumur unggulan dengan 40-60 L4 tahap hermafrodit nematoda N2 dan assay infeksi dilakukan pada 25 ° C selama 24 jam. Dalam bioassay ini, nematoda dianggap mati ketika ada gerakan yang diamati bawah mikroskop binokuler dan ketika penyadapan lembut nematoda oleh jarum tidak menimbulkan respon apapun. Mortalitas nematoda yang didefinisikan sebagai rasio nematoda mati atas diuji NEMA- todes. Semua percobaan dilakukan dalam tiga ulangan dan diulang setidaknya tiga kali.
IPCR untuk Mengidentifikasi Gen
Virulensi Calon Inverse PCR (IPCR) dilakukan sesuai dengan standar prosedur (Le Breton et al. 2006) yakni sebagai berikut: 1.   Genomic Sampel DNA diisolasi dari mutan yang berasal dari transposon mutagenesis yang pertama kali dicerna dengan enzim dan TaqI maka DNA linear dicerna yang diedarkan di ligasi 2.   Melakukan pereaksian menggunakan T4 ligase (Takara, Dalian, Cina) pada DNA konsentrasi 5 ng / ml. IPCR dilakukan dengan template dari 100 ng DNA diikat menggunakan primer dari oIPCR1 dan oIPCR2, yang menghadap ke luar dari urutan transposon. Produk IPCR dimurnikan menggunakan kit recovery (Biotek, Beijing, Cina), dan produk tersebut kemudian dihubungkan diikat ke plasmid PMD-18 T (Takara) dan sekuensing dengan PMD-18 T primer universal.
ESI-TOF-MS
Setelah strain bakteri yang diuji ditanam dalam produksi medium yang mengandung 1,5% agar pada suhu 37 ° C selama 24 jam, bakteri rumput dari empat lempeng pertumbuhan dikumpulkan ke dalam 50 ml tabung centrifuge dengan 30 ml campuran dari 70% asetonitril dan 30% air yang mengandung konsentrasi akhir 0,1% formiat asam. Setelah vortexing menyeluruh dan kemudian sentrifugasi pada 8.000 rpm selama 20 menit, supernatan telah dihapus dan dimurnikan dengan filter 0,45 um dan berturut-turut dikeringkan dengan rotary evaporator. Sampel dilarutkan dalam 2 ml campuran dari 90% asam format dan 10% asetonitril untuk ionisasi elektrospray waktu-of-penerbangan spektrometri massa (ESI-TOF-MS) analisis. Analisis ESI-TOF-MS diterapkan di LC / TOF-MS dengan ESI beroperasi dalam mode positif, dan dicapai dengan menggunakan sistem HPLC (autosampler, dan pompa biner, Agilent Series 1100, Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Operasi berikut param- eters yang digunakan dalam analisis kami: fase gerak terdiri dari pelarut A (60% air steril), pelarut B (20% asetonitril) dan pelarut C (20% isopropil alkohol) pada aliran konstan 100 ml / min; tegangan kapiler 3000 V; Tekanan nebulizer 40 psig; pengeringan aliran gas 7 L / menit; suhu pengeringan gas 300 ° C; fragmentor tegangan 210 V; tegangan skimmer 60 V. LC / TOF-MS akurat spektrum massa tercatat di berbagai 50-3100 m / z. Pengolahan data dilakukan dengan Terapan Biosystems / MDS-SCIEX QS Analyst perangkat lunak (Frankfurt, Jerman) dengan massa akurat tambahan aplikasi khusus dari Agilent MSD Software TOF (Valverde et al 2010; Arraez-Roman et al 2010). Bioassay aktivitas nematicidal ke permukaan ekstraksi Ekstraksi metabolit dari permukaan sel disusun dengan menggunakan metode yang sama dijelaskan di atas, kecuali bahwa kering ekstraksi permukaan sel dilarutkan dalam metanol menghasilkan konsentrasi 40 mg /ml. Kemudian 20 μlliquorprepared di atas dicampur dengan 380 ml air steril dan ditambahkan ke dalam piring 16-baik, mencapai konsentrasi akhir permukaan sel ekstraksi sebagai 2mg/ml.After penyemaian 40-60 L4 tahap hermaprodit nematoda N2 dalam setiap sumur, uji diinkubasi pada 25 ° C selama 24 jam. Campuran yang mengandung 5% metanol dan 95% air steril digunakan sebagai kontrol negatif.
c.   HASIL
