Skrining perpustakaan transposon untuk mutan dilemahkan virulensi
Sebelum skrining perpustakaan mutagenesis transposon-penyisipan Bacillus amyloliquefaciens FZB42 diidentifikasi mutannya dengan dilemahkan menggunakan aktivitas nematicidal, mutan auksotrofik pertama kali diidentifikasi dan mutan ini dikeluarkan dari analisis lebih lanjut. Setelah awal screening 400 mutan di perpustakaan, hanya 75% dari mutan acak kemudian diuji untuk kegiatan nematicidal mereka. Akhirnya, uji kami mengidentifikasi 46 mutan yang menunjukkan penurunan virulensi dibandingkan dengan strain induk. Di antara mereka, F5 strain mutan adalah salah satu calon. Dalam cairan cepat membunuh assay, angka kematian kurang dari 10% diperoleh dalam waktu 4 jam dalam Mutan F5 ketika 31,3 ± 4,7% nematoda dibunuh oleh strain induk FZB42. Jika waktu infeksi diperpanjang sampai 16 jam, 53,2 kematian ± 2,6% diperoleh pada F5 sementara pengobatan mutan kurang dari 10% nematoda selamat dalam pengobatan tipe liar FZB42 (Gambar 1a). Dalam uji pembunuhan lambat, nematoda diperlakukan dengan mutan F5 memiliki kelangsungan hidup 10% lebih tinggi dari tipe liar saring selama periode uji keseluruhan. Selain itu, F5 mutan dibutuhkan setidaknya satu hari tambahan untuk membunuh 50% dari terkena nematoda dalam uji ini (Gambar 1b). Dengan demikian, hasil di atas menunjukkan bahwa transposon penyisipan F5 mutan terdapat mutasi yang berdampak negatif terhadap aktivitas nematicidal nya.
Identifikasi Gen Kandidat Dalam Mutan F5
Mengambil DNA genomik TaqI-dicerna sebagai template, IPCR dengan sepasang primer oIPCR1 dan oIPCR2 (Le Breton et al. 2006), yang dihadapi keluar dari urutan transposon, adalah dilakukan untuk mengidentifikasi gen (s) terganggu dalam mutan F5. Setelah amplikon disekuensing, kami memilih fragmen DNA yang berisi urutan parsial Tc1/himar1 mariner transposon vektor pada dua ujung terminal. Hal ini karena TnYLB-1 plasmid transposes dengan mekanisme 'cut-and-paste' (Le Breton et al 2006; pada Gambar 2b). Analisis peneliti menunjukkan bahwa tiga gen dalam mutan F5 terganggu oleh transposon: RBAM_007470, yhdY, dan prkA. RAMB_007470 terletak dalam sebuah cluster 12 gen, sekitar 10 kb panjang, dan bahwa ini klaster dikodekan protein docking / perancah dalam protein kompleks untuk biosintesis senyawa Tomm (Garsin et al. 2001; Gambar. 2a). Dua gen lain (yhdY dan prkA) yang juga terganggu di F5 dan kedua gen masing-masing dikodekan protein keluarga MSC uncharacterized yang mungkin berfungsi dalam transportasi transmembran dan protein kinase serin (Earl et al. 2012; Fischer et al. 1996) Gangguan Gen RBAM_007470 disebabkan Dilemahkan Kegiatan Nematicidal Untuk menentukan mana dari tiga gen transposon-terganggu mengakibatkan hilangnya virulensi dalam F5, peneliti mempekerjakan vektor integrasi pMUTinNC untuk membangun plasmid bunuh diri mengandung fragmen DNA internal dari tiga gen bermutasi masing-masing dari tiga gen secara terpisah. Sebuah fragmen DNA internal RBAM_007470 adalah PCR diamplifikasi. Amplikon dari 464 bp dihubungkan ke pMD18-T, dibelah dengan HindIII dan BamHI, dikloning ke pMUTinNC, dan menghasilkan plasmid rekombinan PNC-007470 untuk gen lokus-diarahkan mutagenesis. itu plasmid konstruk diperkenalkan ke B. amyloliquefaciens FZB42 strain oleh chemotransformation. Transformasi dan kromosom acara keberhasilan integrasi plasmid ke dalam Gen RBAM_007470 dikonfirmasi dengan PCR melalui memperkuat knock-out target RBAM_007470 gen kita juga sebagai knock-in gen anti-eritromisin. Dua mutagenesis locusdirected lain yhdY dan prkA dibangun dengan metode yang sama (data tidak ditampilkan). Setelah bioassaying tiga mutan tertentu dan kemudian membandingkan aktivitas nematicidal mereka ke induk galur wild type FZB42 serta F5 mutan, kami menemukan bahwa gangguan RBAM_007470 gen menyebabkan penurunan serupa nematicidal kegiatan seperti yang dilakukan F5 mutan. Sebaliknya, tidak ada penurunan Kegiatan nematocidal diamati untuk mutasi pada dua gen lain yhdY dan prkA. Sebaliknya, mutan ΔRBAM_007470 dibunuh hanya 50,6 ± 3,3% nematoda setelah 16 h dan butuh 28 jam untuk membunuh semua nematoda (Gambar 1a). Dalam uji pembunuhan lambat, mutan ΔRBAM_007470 diperlukan setidaknya satu hari tambahan untuk membunuh 50% dari terkena nematoda, mirip dengan yang ada pada F5 mutan. Metabolit Plantazolicin Berfungsi Sebagai Faktor Virulensi Cluster gen yang mengandung gen RABM_007470 telah ditemukan penting untuk biosintesis plantazolicin (Scholz et al. 2011). Dalam cluster ini, RABM_007470 gen adalah diusulkan berfungsi sebagai protein docking / perancah di kompleks protein yang terdiri dari cyclodehydratase (C), dehidrogenase (B), dan protein docking / perancah (D). Kami berhipotesis bahwa gangguan dari gen RABM_007470 menyebabkan penghapusan plantazolicin, yang kemudian menyebabkan Kegiatan nematicidal dilemahkan di Bacillus amyloliquefaciens FZB42. Untuk mengidentifikasi perbedaan metabolit mereka, ekstrak permukaan dari Bacillus amyloliquefaciens FZB42 dan ΔRABM_007470 mutan yang diuji oleh ESI-TOF-MS, masing masing. Senyawa ([M + H + H2O] +) dengan molekul massa 1354 Da terdeteksi di alam liar-jenis strain tetapi absen di mutan ΔRBAM_007470 (Gambar 3). Fitur senyawa ini konsisten dengan plantazolicin dilaporkan sebelumnya (Scholz et al. 2011). Hasil penelitian menunjukkan bahwa ΔRABM_007470 gen serta seluruh gen cluster bertanggung jawab untuk biosintesis plantazolicin.   Gambar 3. ESI-TOF-MS detecting metabolites from organic extracts of B amyloliquefaciens FZB42 and ΔRBAM_007470 strains. (a)ESI- TOF-MS of cpd1354 [M+H] + from B. amyloliquefaciens FZB 42 in an m/zrangeof900to1600Da.(b) The corresponding metabolite cpd1354 [M+H] + could not be detected by ESI-TOF-MS in the ΔRBAM_007470 strain. Untuk lebih memastikan apakah penurunan aktivitas nematicidal dihasilkan dari adanya plantazolicin, kami menentukan virulensi metabolit ekstraseluler dari kedua tipe liar saring dan theΔRABM_007470 mutan terhadap nematoda. Hasil penelitian menunjukkan bahwa tidak ada perbedaan yang jelas dalam kematian nematoda dalam awal 2 jam. Sampai dengan 24 jam, ekstraseluler metabolit dari mutan ΔRABM_007470 menunjukkan virulensi 10-20% lebih rendah dibandingkan dengan wild type galur (Gambar 4). Setelah 24 jam, kegiatan nematicidal menurun secara dramatis di kedua galur wild type dan ΔRABM_007470 yang mutan, mungkin karena konsentrasi yang lebih rendah atau kehilangan aktivitas metabolit permukaan. Dengan demikian, hasil kami di sini menunjukkan bahwa produk metabolisme yang mengandung senyawa plantazolicin memiliki aktivitas nematicidal lebih tinggi, menunjukkan virulensi potensial faktor dalam B. amyloliquefaciens FZB42.  Fig. 4 Nematicidal activity of surface extracts of B. amyloliquefaciens FZB42 and ΔRBAM_007470 strains. 40–60 L4 stage C. elegans worms and 2mg/ml cell surface extractionwere seeded in 16well plates at 25 °C, respectively. 5 % methanol and 95 % sterile water was used as negative control. The Y axis represents the percentage of nematode survival, and the X axis represents the time (in hours) after tests began.
d.   PEMBAHASAN
Ditetapkan perpustakaan mutan telah memungkinkan genom skala efisien penyaringan dan menyediakan koleksi nyaman mutasi untuk hampir semua gen yang tidak penting dari bunga (Cameron et al. 2008). Di sisi lain, urutan genom dan terkait informasi penjelasan juga memfasilitasi generasi tinggi-throughput perpustakaan mutan yang komprehensif. Dengan demikian, pendekatan ini telah berhasil digunakan untuk mengidentifikasi gen-virulensi terkait dalam berbagai patogen terhadap nematoda seperti Pseudomonas aeruginosa dan B. subtilis (Xia et al. 2011). Serupa dengan dua kasus yang berhasil, di sini kami mengidentifikasi faktor-faktor nematotoxic dan memperoleh wawasan ke dalam mekanisme patogenesis Bacillus amyloliquefaciens FZB42 menggunakan acak transposon-penyisipan mutagenesis, di mana hampir semua ORFs di FZB42 yang genome telah terganggu setidaknya sekali. Tidak termasuk pengaruh dari mutasi pada pertumbuhan terganggu dan kelangsungan hidup, kami menemukan bahwa gangguan dari gen RBMA_007470 di Bacillus amyloliquefaciens FZB42 penurunan aktivitas nematicidal di kedua acak transposon-penyisipan F5 mutan dan ΔRABM_007470 mutan locus terdeteksi. Meskipun dua gen lainnya yhdY dan prkA juga terganggu dalam mutan F5, selanjutnya eksperimen untuk dua lokus-diarahkan mutagenesis regangan menunjukkan kegiatan nematicidal mirip dengan tipe liar, menunjukkan tidak ada kontribusi yang jelas dari kedua gen aktivitas nematotoxic. RBAM_007470 (pznD) merupakan bagian dari cluster 12-gen (PZN cluster) yang mencakup sekitar 10 kb dan terlibat dalam sintesis plantazolicin (PZN). Telah dilaporkan bahwa cluster gen ini adalah coding untuk PznA prepropeptide, dan PznBCD trimerik kompleks protein (cyclodehydratase [C], dehidrogenase [B] dan protein docking / perancah [D]) encoding posttranslational modifikasi (Scholz et al. 2011). Struktur dari antibiotik peptida ribosomally disintesis, plantazolicin A dan B, telah baru-baru dijelaskan (Kalyon et al 2011;. Molohon et al. 2011). Karena genetik dan kimia konservasi struktur mereka, plantazolicin diklasifikasikan ke dalam kelompok Tomm dari metabolit (Haft et al. 2010). Plantazolicin A dan desmethyl nya plantazolicin analog B merupakan jenis yang tidak biasa thiazole / oxazole mengandung antibiotik peptida (Tomm). Sebuah fitur struktural yang unik dari plantazolicin A adalah kedekatan dari dua gugus pentaheterocyclic yang terutama memberi struktur planar untuk peptida dan mengingatkan telomerase inhibitor telomestatin (Shin-ya et al. 2001). Dalam sintesis plantazolicin proses, trimerik "BCD" fungsi kompleks dalam dua berbeda transformasi kimia. Yang pertama dikatalisis oleh cyclodehydratase (C), yang mengubah Cys dan Ser / Thr residu ke thiazoline sesuai dan (metil) oksazolin dengan hilangnya air dari backbone amida. Dalam kedua, dehydrogenase (B) menghilangkan dua elektron dan dua proton untuk membayar thiazole aromatik dan (metil) oxazole (Li et al 1996.; Milne et al. 1999). Protein docking perancah (D) tampaknya memainkan peran dalam perakitan trimer dan regulasi enzimatik aktivitas. Mekanisme ini juga sama digunakan dalam biosintesis yang jalur untuk streptolisin S (Datta et al. 2005), dan B17 microcin (Li et al. 1996). Analisis kami sebelumnya mengungkapkan bahwa gangguan salah satu anggota dari kompleks protein BCD mengarah ke hilangnya lengkap produksi plantazolicin di FZB42 (Scholz et al 2011). Di sini, kita menguatkan bahwa menemukan khusus untuk PznD: transposon penyisipan ke RBAM_007470 gen (pznD) ledtoa kerugian lengkap dalam biosintesis plantazolicin. Saat ini, fungsi dari jenis produk alami memiliki belum sepenuhnya dijelaskan belum. Streptolisin S disekresikan oleh patogen manusia S. pyogenes adalah racun yang sangat cytolytic dan memberikan kontribusi untuk fenotipe hemolitik bakteri ini. Plantazolicin fromB. amyloliquefaciens FZB42 telah terbukti sebagai spektrum sempit senyawa antibakteri (Molohon et al 2011). Hal ini dapat menghambat pertumbuhan terkait erat Gram-positif bakteri, misalnya Bacillus anthracis, tetapi tidak menunjukkan aktivitas terhadap Bakteri Gram negatif. Namun, kegiatan tersebut hanya diamati ketika konsentrasi tinggi metabolit telah diterapkan. Data yang disajikan di sini menjelaskan kegiatan untuk memusuhi nematoda akar-simpul yang telah diamati sebelumnya (Burkett-Cadena et al. 2008) dan menunjukkan peran novel plantazolicin dalam membunuh nematoda akar-simpul. Kegiatan seperti ini dapat menyebabkan perkembangannya sebagai agen untuk pengendalian biologis. Penelitian kami adalah laporan pertama yang menunjukkan bahwa plantazolicin diproduksi oleh B. amyloliquefaciens FZB42 kontribusi untuk perusahaan aktivitas nematicidal. Modus rinci tindakan plantazolicin terhadap nematoda menunggu penyelidikan lebih lanjut, namun struktural kesamaan dengan telomerase inhibitor telomestatin bisa berfungsi sebagai pertama titik awal untuk penelitian lebih lanjut.
