Isolasi dan kultur preadiposit primer dari jaringan lemak epididimis tikus jantan SD dilakukan dengan beberapa modifikasi dari metode yang sudah ada . Secara singkat, pad lemak epididimis dari tikus diambil dalam kondisi steril, dicuci dengan larutan saline, dipotong kecil-kecil, dan diinkubasi pada suhu 37 C dengan kolagenase tipe I (17100017, Gibco, Gaithersburg, MD, USA). Jaringan yang dicerna disaring melalui saringan sel steril 100 m. Preadiposit primer yang terisolasi disuspensikan dalam media DMEM-F12 yang mengandung rosiglitazon sebelum pengujian dimulai.
 DIFERENSIASI ADIPOSIT DAN PEWARNAAN OIL RED O
Dua hari setelah sel mencapai konfluensi (hari 0), sel distimulasi dengan medium induksi IBMX, DEX, dan insulin (MDI cocktail) (media DMEM yang mengandung 10% FBS inaktif, 0,5 mM IBMX, 1 M/mL DEX, dan 1 g/mL insulin) dan diperlakukan dengan berbagai konsentrasi papain (6,25, 12,5, dan 25 g/mL). Tiga hari setelah stimulasi dengan MDI (hari 3), sel dikultur dalam medium insulin (media DMEM yang mengandung 10% FBS inaktif dan 1 g/mL insulin) dan diperlakukan dengan berbagai konsentrasi papain. Tiga hari kemudian (hari 6), sel dikultur dalam 10% FBS/DMEM dan diperlakukan dengan berbagai konsentrasi papain. Untuk adiposit primer tikus, digunakan medium MDI (media DMEM-F12 yang mengandung 5% FBS inaktif, 0,5 mM IBMX, 1 M/mL DEX, dan 5 g/mL insulin) dan medium insulin (media DMEM-F12 yang mengandung 5% FBS inaktif dan 5 g/mL insulin). Diferensiasi penuh tercapai pada hari ke-8. Sel yang terdiferensiasi difiksasi dalam formalin 10% selama 60 menit. Setelah itu, larutan fiksasi dibuang dan sel diinkubasi dalam larutan pewarna Oil Red O (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) selama 3 jam. Setelah itu, sel di-destain dengan isopropanol 40%. Oil Red O dielusi dengan menginkubasi sel dalam 1 mL isopropanol 100% selama 10 menit. Akumulasi lipid dalam sampel diukur dengan mengukur kepadatan optik menggunakan spektrofotometer pada 520 nm.
HASIL PENELITIAN PENURUNAN OBESITASÂ
Papain Mengurangi Berat Hati dan Akumulasi Lipid Hati pada Mencit Obesitas yang Diinduksi HFD Untuk memeriksa efek papain terhadap akumulasi lipid hati, warna hati diamati, dan berat jaringan hati diukur pada setiap kelompok. Warna hati pada kelompok HFD terlihat kuning muda, sementara pada kelompok ND berwarna merah gelap, sedangkan warna hati kelompok HFD yang diberi perlakuan papain berubah menjadi merah gelap (Gambar 2a). Meskipun tidak ada perbedaan berat hati antara kelompok ND dan HFD pada minggu ke-9, mencit HFD yang diberi perlakuan papain menunjukkan penurunan berat hati yang signifikan dibandingkan dengan mencit yang diberi pakan HFD (Gambar 2b). Analisis histopatologis jaringan hati menunjukkan jumlah droplet lipid yang teridentifikasi secara mikroskopis lebih banyak dan akumulasi lipid yang lebih tinggi pada kelompok HFD dibandingkan dengan kelompok ND. Sementara itu, pemberian papain mengakibatkan penurunan yang nyata pada droplet lipid ini (Gambar 2c). Selain itu, pemberian papain pada mencit tidak menunjukkan efek toksik signifikan pada AST dan ALT, yang merupakan indikator sensitif kerusakan hati, yang menunjukkan bahwa papain menginduksi penurunan berat badan dan akumulasi lipid tanpa toksisitas pada mencit obesitas yang diinduksi HFD (Gambar 2d,e).
Pengaruh Papain terhadap Steatosis Hati pada Mencit Obesitas yang Diinduksi HFD (a) Analisis makroskopik jaringan hati mencit dari berbagai kelompok pada mencit yang mengalami obesitas akibat pakan HFD. (b) Berat hati pada mencit yang diberi pakan HFD. (c) Gambar histologis representatif jaringan hati yang dianalisis menggunakan pewarnaan H&E (perbesaran asli; 200). Jaringan hati dari mencit yang mewakili setiap kelompok difiksasi, dibenamkan dalam parafin, dan diwarnai dengan H&E. (d) Tingkat serum AST dan (e) ALT pada mencit obesitas yang diinduksi HFD
 Papain Mengatur Ekspresi Marker Adipogenik dan Inflamasi di Hati Mencit Obesitas yang Diinduksi HFD
Untuk menginvestigasi dasar molekuler dari efek anti-obesitas papain, ekspresi mRNA dan protein faktor transkripsi adipogenik diukur. Seperti yang terlihat pada Gambar 3a, ekspresi protein PPAR, C/EBP, dan SREBP-1 meningkat pada hati mencit yang diberi pakan HFD. Namun, perlakuan dengan papain secara signifikan menurunkan ekspresi protein marker tersebut di hati mencit HFD. Ekspresi mRNA PPAR, C/EBP, dan SREBP-1 juga berkurang setelah perlakuan papain pada mencit HFD (Gambar 3b). Diketahui bahwa jalur sinyal AMPK mengatur ekspresi faktor adipogenik [27]. Oleh karena itu, kami memeriksa apakah papain mempengaruhi aktivasi AMPK. Ekspresi protein AMPK yang terfosforilasi menurun pada kelompok HFD dibandingkan dengan kelompok ND, sementara setelah perlakuan papain, ekspresi tersebut meningkat secara signifikan .
Papain Mengurangi Berat Lemak Adiposa dan Menghambat Hipertrofi Adiposit pada Mencit Obesitas yang Diinduksi HFDJaringan adiposa putih adalah tempat utama penyimpanan lipid, dengan depot utama pada rodensia meliputi pad epididimal, visceral, dan mesenterik [28]. Oleh karena itu, kami mengukur rasio berat lemak epididimal terhadap berat badan dan rasio berat lemak visceral terhadap berat badan. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4a,b, rasio berat lemak epididimal dan visceral terhadap berat badan pada kelompok HFD meningkat hampir dua kali lipat dibandingkan dengan kelompok ND. Namun, perlakuan dengan papain secara signifikan mengurangi rasio berat lemak epididimal dan visceral terhadap berat badan dibandingkan dengan kelompok HFD. Analisis histologis menunjukkan bahwa adiposit pada jaringan lemak epididimal kelompok HFD lebih besar (111,0 11,06 m) dibandingkan dengan kelompok ND (64,1 9,95 m). Perlakuan papain secara nyata mengurangi pembesaran adiposit hingga tingkat yang serupa dengan kelompok ND (Gambar 4c). Hasil ini menunjukkan bahwa papain efektif dalam mencegah akumulasi lipid dan hipertrofi adiposit.
Papain Mengatur Adipokin dan Infiltrasi Makrofag dalam Jaringan Adiposa pada Mencit Obesitas yang Diinduksi HFD
Untuk memastikan peradangan pada jaringan adiposa mencit yang diberi pakan HFD, kami menilai ekspresi adipokin. Pemberian HFD menyebabkan peningkatan signifikan dalam ekspresi mRNA TNF-, IL-6, MCP-1, dan leptin. Namun, papain menurunkan tingkat ekspresi ini (Gambar 5a). Selain itu, kami mencatat penurunan ekspresi mRNA adiponektin pada mencit yang diberi pakan HFD dibandingkan dengan kelompok ND; meskipun demikian, ekspresi adiponektin meningkat setelah perlakuan papain, tetapi perbedaannya tidak signifikan (Gambar 5b). Ekspresi F4/80 menunjukkan peningkatan signifikan dengan tingkat infiltrasi makrofag yang lebih tinggi di sekitar adiposit pada jaringan adiposa mencit yang diberi pakan HFD dibandingkan dengan kelompok ND. Namun, infiltrasi makrofag ini berkurang dengan perlakuan papain (Gambar 5c,d). Hasil ini menunjukkan bahwa penurunan berat jaringan adiposa pada kelompok perlakuan papain dapat disebabkan oleh penghambatan akumulasi lipid dan hipertrofi adiposit akibat penurunan diferensiasi adiposit serta pengaturan respons inflamasi.
ISOLASI PAPAIN DARI POHON PEPAYA
Isolasi enzim papain dari pohon pepaya (Carica papaya) umumnya dilakukan dengan mengekstrak getah atau lateks dari pohon pepaya, yang mengandung enzim papain. Berikut adalah langkah-langkah umum untuk isolasi enzim papain dari pohon pepaya:
