Pepaya, Papain dan Penurunan Obesitas

Di belakang rumah, terdapat kebun yang dipenuhi dengan empat pohon pepaya California. Buahnya begitu melimpah sehingga saya tidak pernah perlu membeli pepaya, dan sering kali membagikan buahnya kepada tetangga yang datang berkunjung. Pohon-pohon pepaya ini tumbuh subur karena sering dipupuk dengan kompos dari limbah organik rumah tangga, cukup untuk memenuhi kebutuhan tiga hingga lima pohon di pekarangan. Jika rajin, buah pepaya ini bisa dijadikan selai atau jelly, yang cocok untuk menemani roti untuk sarapan pagi. Tentu ini bisa menghemat banyak.

Pepaya, dengan warna cerah dan aroma menggoda, tumbuh di pohon hijau yang subur, memberikan rasa manis pada setiap gigitan. Buah ini selalu menjadi impian bagi kami sekeluarga.

Selain memberikan buah yang segar, pepaya juga menghasilkan enzim papain, yang terkandung dalam getahnya dan sangat bermanfaat bagi industri serta kesehatan manusia. Dengan manfaat yang begitu besar, tanaman pepaya dapat dioptimalkan untuk menghasilkan getah pepaya atau papain, dan Indonesia memiliki potensi yang sangat besar untuk mengembangkan tanaman ini.

Menurut laporan BPS 2023, Jawa Timur merupakan produsen pepaya terbesar di Indonesia dengan jumlah produksi mencapai 349.998 ton. Di provinsi ini, jenis pepaya yang paling banyak dihasilkan adalah pepaya California dan Bangkok.  (1) Jawa Tengah berada di urutan berikutnya dengan produksi sebesar 125.866 ton, yang sebagian besar terdiri dari pepaya Bangkok dan Hawaii. (2)Nusa Tenggara Timur menghasilkan 116.321 ton pepaya, termasuk pepaya Bangkok dan Hawaii.  (3) Jawa Barat memproduksi 110.751 ton pepaya, mayoritas berupa pepaya California dan Bangkok. (4) Lampung menyumbang 92.513 ton pepaya, didominasi oleh pepaya California dan Bangkok. (5) Sumatra Barat menghasilkan 39.633 ton pepaya, dengan pepaya Bangkok dan Hawaii sebagai varietas utama.  (6) Sumatra Selatan mencatatkan produksi 39.376 ton pepaya, sebagian besar terdiri dari pepaya California dan Bangkok.  (7) Sumatra Utara menghasilkan 37.257 ton pepaya, dengan pepaya Bangkok dan Hawaii sebagai jenis utama.  (8)Kalimantan Timur memproduksi 29.442 ton pepaya, termasuk pepaya California dan Bangkok. (4) Sulawesi Selatan menutup daftar dengan produksi 28.246 ton pepaya, yang didominasi oleh pepaya Bangkok dan Hawaii.

Papain adalah enzim proteolitik yang terdapat pada daun, buah, akar, dan lateks tanaman Carica papaya (pepaya). Meskipun papain menunjukkan berbagai aktivitas, belum ada laporan mengenai efek anti-obesitasnya. Penelitian ini mengkaji efek anti-obesitas dan mekanisme anti-inflamasi yang terlibat dalam obesitas dari papain pada model in vivo dan in vitro menggunakan tikus obesitas yang diinduksi diet tinggi lemak (HFD) dan preadiposit 3T3-L1. Pemberian papain secara oral mengurangi berat badan, hati, dan jaringan adiposa tikus yang diinduksi HFD. Papain juga mengurangi akumulasi lipid di hati dan ukuran adiposit. Selain itu, kadar kolesterol total dan trigliserida serum menurun secara signifikan pada tikus yang diberi papain. Selain itu, papain menghambat diferensiasi preadiposit dan akumulasi minyak pada preadiposit 3T3-L1 dan preadiposit primer tikus. Secara mekanistik, papain secara signifikan menurunkan tingkat protein regulator utama adipogenesis dan membalikkan ekspresi sitokin pro-inflamasi serta adipokin pada tikus obesitas yang diinduksi HFD dan preadiposit 3T3-L1. Papain juga secara signifikan meningkatkan aktivasi jalur AMP-activated protein kinase pada kedua model tersebut. Secara keseluruhan, hasil ini menunjukkan bahwa papain memiliki efek anti-obesitas pada tikus yang diinduksi HFD dan preadiposit 3T3-L1 dengan mengatur kadar faktor adipogenesis yang terlibat dalam metabolisme lipid dan inflamasi; dengan demikian, papain dapat berguna dalam pencegahan dan pengobatan obesitas.

Dalam tulisan ini, saya akan membahas secara mendalam mengenai enzim papain, manfaatnya dalam membantu penurunan obesitas, serta metode isolasi papain dari pohon pepaya.

SELAYANG PANDANG ENZIM PAPAIN

Papain, yang juga dikenal sebagai papaya proteinase I, adalah enzim protease sistein (EC 3.4.22.2) yang terdapat pada pepaya (Carica papaya) dan pepaya gunung (Vasconcellea cundinamarcensis). Papain merupakan anggota keluarga protease mirip papain yang menjadi nama keluarga tersebut.

Enzim ini memiliki berbagai aplikasi komersial di industri kulit, kosmetik, tekstil, deterjen, makanan, dan farmasi. Dalam industri makanan, papain digunakan sebagai bahan aktif dalam banyak pengempuk daging komersial.

Keluarga Papain

Papain termasuk dalam keluarga protein terkait yang dikenal sebagai keluarga protease mirip papain, dengan berbagai aktivitas, termasuk endopeptidase, aminopeptidase, dipeptidyl peptidase, dan enzim dengan aktivitas exo- dan endopeptidase . Anggota keluarga papain tersebar luas, ditemukan dalam baculovirus, eubakteri, ragi, dan hampir semua protozoa, tanaman, serta mamalia . Protein-protein ini biasanya bersifat lisosomal atau disekresikan, dan pemecahan proteolitik dari propeptida diperlukan untuk aktivasi enzim, meskipun bleomisin hidrolase bersifat sitosolik pada jamur dan mamalia . Protease sistein mirip papain pada dasarnya disintesis sebagai proenzim tidak aktif (zimogen) dengan daerah propeptida terminal N. Proses aktivasi enzim-enzim ini melibatkan penghapusan daerah propeptida, yang memiliki berbagai fungsi in vivo dan in vitro. Daerah propeptida diperlukan untuk pelipatan yang tepat dari enzim yang baru disintesis, inaktivasi domain peptidase, dan stabilisasi enzim terhadap denaturasi pada kondisi pH netral hingga basa. Asam amino dalam daerah propeptida memediasi asosiasi membran mereka, dan berperan dalam transportasi proenzim ke lisosom. Salah satu fitur yang paling menonjol dari propeptida adalah kemampuannya untuk menghambat aktivitas enzim terkait dan bahwa beberapa propeptida menunjukkan selektivitas tinggi untuk menghambat peptidase dari mana mereka berasal

Struktur

Protein prekursor papain mengandung 345 residu asam amino  dan terdiri dari urutan sinyal (1-18), propeptida (19-133), dan peptida matang (134-345). Nomor asam amino didasarkan pada peptida matang. Protein ini distabilkan oleh tiga jembatan disulfida. Struktur tiga dimensinya terdiri dari dua domain struktural yang terpisah dengan celah di antaranya. Celah ini mengandung situs aktif, yang berisi dyad katalitik yang telah disamakan dengan triad katalitik dari kimotripsin. Dyad katalitik terdiri dari asam amino sistein-25 (yang memberi nama klasifikasinya) dan histidin-159. Aspartat-158 dianggap memainkan peran yang setara dengan peran aspartat dalam triad katalitik protease serin, tetapi itu kemudian dibantah

Fungsi
Mekanisme papain dalam memutus ikatan peptida melibatkan penggunaan dyad katalitik dengan sistein yang terdeprotonasi . Asn-175 yang berada di dekatnya membantu mengarahkan cincin imidazol His-159 untuk memungkinkan deprotonasi sistein katalitik Cys-25. Sistein ini kemudian melakukan serangan nukleofilik pada karbonil karbon dari tulang punggung peptida. Ini membentuk intermediat enzim asil-kovalen dan membebaskan ujung amino dari peptida. Enzim ini kemudian dideasilasi oleh molekul air dan melepaskan bagian karboksil terminal dari peptida. Dalam imunologi, papain dikenal dapat memotong bagian Fc (bagian kristalisabel) dari imunoglobulin (antibodi) dari bagian Fab (pengikat antigen).

Papain adalah enzim yang relatif tahan panas, dengan kisaran suhu optimal antara 60 hingga 70 C

Papain lebih suka memotong setelah arginin atau lisin yang didahului oleh unit hidrofobik (Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Tyr) dan tidak diikuti oleh valin

Penggunaan

Papain memecah serat daging yang keras, dan telah digunakan sebelum kontak dengan Eropa untuk melembutkan daging yang dimakan di Amerika Selatan asli. Pengempuk daging dalam bentuk bubuk dengan papain sebagai komponen aktif banyak dijual, dan penggunaan kulit pepaya dalam masakan telah dibahas dalam beberapa makalah penelitian

Papain dapat digunakan untuk mendissosiasi sel pada langkah pertama persiapan kultur sel. Perlakuan selama sepuluh menit pada potongan jaringan kecil (kurang dari 1 mm) akan memungkinkan papain mulai memecah molekul matriks ekstraseluler yang menahan sel-sel bersama-sama. Setelah sepuluh menit, jaringan harus diperlakukan dengan larutan inhibitor protease untuk menghentikan aksi protease. Jika tidak diobati, aktivitas papain akan menyebabkan lisis sel yang lengkap. Jaringan kemudian harus dihancurkan (dilewatkan dengan cepat naik turun melalui pipet Pasteur) untuk memecah potongan-potongan jaringan menjadi suspensi sel tunggal.

Papain juga digunakan sebagai bahan dalam berbagai persiapan debridement enzimatik, terutama Accuzyme. Ini digunakan dalam perawatan beberapa luka kronis untuk membersihkan jaringan mati.

Papain ditambahkan ke beberapa pasta gigi dan permen mint sebagai pemutih gigi. Efek pemutihnya minimal, karena papain hadir dalam konsentrasi rendah dan cepat terlarut oleh air liur. Dibutuhkan beberapa bulan penggunaan untuk mendapatkan efek yang terlihat.

Pohon Pepaya dan struktur Papain (Sumber : Pohon pepaya /dokpri; Struktur papain / dream.time)

PAPAIN ,MENURUNKAN OBESITAS

Beberapa penelitian pada hewan menunjukkan bahwa papain dapat membantu memperlambat penambahan berat badan dengan mengurangi akumulasi lemak tubuh dan lemak darah. Hasil serupa juga ditemukan pada studi jus pepaya. Namun, penelitian pada manusia masih diperlukan untuk memverifikasi hasil ini.

Obesitas adalah faktor risiko utama yang berkontribusi pada sejumlah penyakit kronis, termasuk diabetes, hipertensi, hiperlipidemia, penyakit kardiovaskular, dan kanker, dengan prevalensinya yang semakin meningkat hingga mencapai proporsi epidemi dalam beberapa dekade terakhir. Sebagian besar obat untuk pengobatan obesitas telah ditarik dari pasar karena efek sampingnya; oleh karena itu, pilihan terapi konvensional saat ini untuk pengobatan orang obesitas tidak mencukupi. Penelitian telah menunjukkan bahwa berbagai sumber alami memiliki potensi untuk dikembangkan sebagai agen anti-obesitas alami karena aksi biologisnya dan adanya senyawa fitokimia aktif.

Adipogenesis didefinisikan sebagai proses di mana preadiposit berdiferensiasi menjadi adiposit. Proses ini dapat dijelaskan dalam dua langkah: peningkatan jumlah preadiposit dan diferensiasi preadiposit menjadi adiposit matang . Diferensiasi preadiposit menjadi adiposit diatur oleh jaringan kompleks faktor transkripsi yang bertanggung jawab atas ekspresi protein kunci yang menginduksi pembentukan adiposit matang. Proses adipogenesis juga melibatkan perubahan morfologi sel, induksi sensitivitas insulin, dan perubahan kapasitas sekretori sel pada berbagai tahap diferensiasi. Pada sel mamalia, CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP), peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR), dan sterol regulatory element-binding protein (SREBP)-1 adalah regulator utama adipogenesis. C/EBPs memainkan peran penting dalam mengaktifkan ekspresi PPAR pada tahap awal diferensiasi [6], PPAR mempromosikan ekspresi gen lipogenik, dan SREBP-1 menginduksi sintesis asam lemak, seperti acetyl-CoA carboxylase dan fatty acid synthase. Sementara itu, obesitas adalah kondisi yang mendasari penyakit inflamasi dan metabolik. Sebagai faktor risiko kuat untuk banyak penyakit, obesitas membuat tubuh terpapar pada keadaan pro-inflamasi melalui peningkatan kadar mediator inflamasi seperti tumor necrosis factor (TNF)-, interleukin (IL)-6, leptin, dan penurunan kadar adiponektin yang disekresikan oleh jaringan adiposa. Keluarga sitokin dan hormon ini secara kolektif disebut adipokin. Adipokin ini mengatur proliferasi dan apoptosis adiposit dengan mempromosikan lipolisis, menghambat sintesis lipid, dan menurunkan lipid darah melalui mekanisme autokrin dan parakrin . AMP-activated protein kinase (AMPK) adalah pengatur energi penting untuk metabolisme energi di berbagai jaringan. Telah dilaporkan bahwa AMPK menghambat sintesis asam lemak, kolesterol, isoprenoid, dan gluconeogenesis hati, sementara meningkatkan transportasi glukosa otot, oksidasi asam lemak, dan asupan kalori . Di jaringan adiposa, AMPK diaktifkan sebagai respons terhadap berbagai rangsangan ekstraseluler. Oleh karena itu, peran kunci AMPK dalam memprogram ulang metabolisme telah banyak diteliti sebagai jalur terapeutik potensial dalam pengobatan beberapa penyakit metabolik seperti diabetes, obesitas, kanker, dan inflamasi . Dengan demikian, AMPK adalah target molekuler dari obat yang digunakan dalam pengobatan penyakit metabolik, termasuk obesitas.

Carica papaya, yang termasuk dalam keluarga Caricaceae, adalah tanaman tropis yang berguna dan dimakan sebagai buah segar serta dalam bentuk minuman, selai, dan permen. Secara khusus, lateksnya mengandung enzim yang digunakan dalam industri makanan, kulit, dan farmasi. Papain adalah protease sistein yang diisolasi dan dikarakterisasi dari C. papaya dan diklasifikasikan sebagai enzim proteolitik yang memerlukan grup sulfhidril bebas untuk aktivitasnya. Enzim ini telah dipelajari secara luas untuk berbagai aplikasi di berbagai bidang seperti industri makanan, pelunakan daging, desain obat, dan persiapan farmasi. Sebagai ramuan obat tradisional, papain digunakan untuk mengurangi rasa sakit, peradangan, infeksi, pembengkakan, diare, dan alergi, selain memperbaiki pencernaan. Papain juga dikenal karena sifat penyembuhan luka, aktivitas antibakteri, serta menunjukkan efek penghambatan pada aktivasi platelet , pembentukan agregat monosit-platelet , strongyloidiasis aterosklerosis, dan adhesi peritoneal Namun, efeknya terhadap obesitas belum dipelajari. Menariknya, telah dilaporkan bahwa ekstrak buah C. papaya dalam bentuk air memiliki efek anti-obesitas pada tikus obesitas yang diberi diet tinggi lemak dan ekstrak air dari daunnya menunjukkan aktivitas anti-hiperglikemik dan hipolipidemik pada model tikus diabetes yang diinduksi alloksan

 Diperkirakan bahwa C. papaya dapat berkontribusi pada pencegahan dan pengobatan obesitas serta gangguan metabolik yang terkait.. Selain itu, C. papaya digunakan dalam pengobatan kondisi inflamasi dan menunjukkan efek anti-inflamasi. Oleh karena itu, kami berhipotesis bahwa papain dapat efektif dalam mengurangi peradangan yang terkait dengan obesitas. Penelitian juga telah menunjukkan bahwa papain terkait dengan pencegahan pembentukan adhesi peritoneal, yang disebabkan oleh respons inflamasi yang semakin mendukung hipotesis kami. Dalam penelitian ini, kami melakukan eksperimen in vivo dan in vitro untuk mengeksplorasi efek papain terhadap obesitas, dan untuk mengungkap mekanisme aksinya pada model tikus obesitas yang diinduksi diet tinggi lemak (HFD), adiposit 3T3-L1, dan adiposit primer tikus. Hasil penelitian menunjukkan bahwa papain menghambat adipogenesis dan mengurangi obesitas serta peradangan yang diinduksi obesitas melalui penghambatan faktor adipogenesis dan sitokin pro-inflamasi melalui aktivasi AMPK.

CARA MEMBUKTIKAN PAPAIN BISA MENURUNKAN OBESITAS 

Langkah pengujian dilakukan pada mencit, sesuai prosedur yang dikembangkan oleh Kang, et al., . (2021, yakni Sebanyak 24 tikus C57BL/6J jantan berusia 4 minggu (berat 20--25 g) diperoleh dari Daehan Biolink Co. (Daejeon, Korea Selatan) dan dipelihara dalam kondisi lingkungan yang terkontrol (suhu 22 3 C, kelembapan 40%--50%, serta siklus cahaya/gelap 12 jam/12 jam). Tikus diberikan waktu adaptasi selama 1 minggu terhadap kondisi pemberian pakan, kemudian diberi akses bebas ke makanan dan air keran selama 9 minggu. Tikus dibagi secara acak ke dalam 3 kelompok, masing-masing terdiri dari 6 ekor: kelompok ND, kelompok HFD (diet 45% lemak, D12451), dan kelompok HFD yang diberikan papain (2,5 atau 5 mg/kg). Semua tikus, kecuali kelompok ND, diberi diet HFD. Papain dilarutkan dalam PBS dan diberikan secara oral setiap hari selama 4 minggu terakhir bersama dengan HFD pada kelompok yang menerima 2,5 atau 5 mg/kg papain. Berat badan tikus dicatat setiap minggu. Pada hari terakhir minggu ke-9, tikus dipuasakan semalam. Sampel darah diambil melalui tusukan jantung, dan jaringan hati serta lemak epididimis dipotong, dicuci, dan disimpan langsung pada suhu 80 C untuk analisis lebih lanjut

 PEMERIKSAAN HISTOLOGI

Jaringan hati dan lemak epididimis difiksasi menggunakan larutan formaldehida 4% (10% formalin) dan kemudian dibenamkan dalam parafin. Untuk pemeriksaan histologi, sampel dipotong dengan ketebalan 8 m dan diwarnai dengan hematoksilin dan eosin (H&E). Slide yang telah diwarnai kemudian diamati dengan mikroskop Leica DM IL LED (Leica, Wetzlar, Jerman).

PEMERIKSAAN PROFIL LIPID SERUM

Sampel darah diambil dan disentrifugasi pada 1700 g selama 15 menit pada suhu ruang untuk memperoleh serum. Sampel yang tidak digunakan segera dibekukan pada 70 C untuk analisis selanjutnya. Kadar serum kolesterol total, AST, dan ALT diukur menggunakan metode enzimatik dengan kit komersial

ANALISIS REVERSE TRANSCRIPTION-QUANTITATIVE POLYMERASE CHAIN REACTION (RT-QPCR)

RNA total diisolasi dari jaringan hati, jaringan adiposa, atau sel menggunakan kit Easy Blue sesuai dengan prosedur yang diberikan oleh produsen. Kuantifikasi RNA total dilakukan menggunakan spektrofotometer volume mikro Epoch (BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA). cDNA diperoleh dengan menggunakan RNA total yang diisolasi (2 g), primer d(T)16, dan Avian Myeloblastosis Virus reverse transcriptase dengan penghilang DNA genomik. Ekspresi gen relatif dihitung menggunakan analisis RT-qPCR (Real Time PCR System 7500; Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA) dengan SYBR Premix Ex Taq. Perubahan lipatan ekspresi gen dihitung dengan metode siklus kuantifikasi komparatif. Nilai Cq dari gen target SREBP-1, PPAR, C/EBP, TNF-, IL-6, IL-1, MCP-1, leptin, adiponektin, FOXO1, SIRT1, AMPK, LKB1, dan CaMKK dinormalisasi terhadap GAPDH menggunakan program ABI Gene Express 2

ANALISIS WESTERN BLOT

Jaringan hati dan sel dihancurkan dalam larutan ekstraksi protein PRO-PREP dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu 4 C. Debris jaringan dihilangkan dengan sentrifugasi mikro pada 11.000 g selama 15 menit, dan supernatan dibekukan dengan cepat. Konsentrasi protein diukur menggunakan reagen uji protein Bio-Rad sesuai instruksi dari produsen (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Protein dipindahkan ke membran poliviniliden difluorida (PVDF) setelah pemisahan pada gel poliakrilamida SDS 10%--12%. Membran diinkubasi selama 1 jam dengan larutan blokir (5% susu skim) pada suhu ruang, kemudian diinkubasi semalam dengan antibodi primer pada suhu 4 C. Blot dicuci tiga kali dengan Tween 20/Tris-buffered saline (T/TBS) dan diinubasi dengan antibodi sekunder terkonjugasi peroksidase lobak (pengenceran 1:2500) selama 2 jam pada suhu ruang. Setelah dicuci tiga kali lagi dengan T/TBS, blot dikembangkan menggunakan reagen kemiluminesensi yang diperkuat (GE Healthcare, Waukesha, WI, USA).

 ANALISIS IMUNOHISTOKIMIA (IHC)

 Jaringan adiposa difiksasi dengan formalin terbuffer 10%, dibenamkan dalam parafin, dipotong setebal 4 m, dan dilakukan pewarnaan IHC. Setelah proses pembenaman parafin, potongan jaringan dicuci dengan xilena, direhidrasi dalam etanol, dan dilanjutkan dengan perawatan air. Aktivitas peroksidase endogen diblokir dengan 0,6% H2O2 dalam 50% metanol, lalu slide dirawat dengan 0,3% Triton dalam PBS untuk permeabilisasi dan diblokir dengan serum kambing normal 10% selama 1 jam, sebelum inkubasi semalam dengan antibodi spesifik untuk F4/80 pada suhu 4 C. Potongan jaringan kemudian dicuci dan diinubasi dengan antibodi sekunder terkonjugasi peroksidase lobak selama 1 jam pada suhu ruang. Aktivitas visualisasi dilakukan dengan kromogen DAB dan pewarnaan balik dilakukan dengan H&E. Perubahan patologis pada seluruh potongan jaringan yang diwarnai diamati menggunakan mikroskop DM IL LED (Leica, Wetzlar, Jerman) dan difoto menggunakan DFC295 (Leica, Wetzlar, Jerman). Gambar digital diambil dari setiap slide (dua per kelompok) dan diukur menggunakan Leica Application Suite (Leica, Wetzlar, Jerman).

 KULTUR PREADIPOSIT 3T3-L1 DAN UJI VIABILITAS SEL

Preadiposit 3T3-L1 diperoleh dari American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Preadiposit 3T3-L1 tikus dikultur dalam DMEM yang mengandung 10% BS, 100 unit/mL penisilin, dan 100 g/mL streptomisin pada suhu 37 C dengan 5% CO2. Viabilitas sel dievaluasi menggunakan uji MTT. Secara singkat, sel diperlakukan dengan masing-masing sampel dan diinkubasi selama 24 jam, kemudian diinubasi dengan larutan MTT (5 mg/mL) selama 4 jam pada 37 C. Setelah membuang supernatan, produk formazan yang terbentuk dilarutkan dalam DMSO. Viabilitas sel diukur pada 540 nm menggunakan pembaca mikrotiter (Titertek Multiskan, Huntsville, AL, USA).

 ISOLASI PREADIPOSIT PRIMER TIKUS

Isolasi dan kultur preadiposit primer dari jaringan lemak epididimis tikus jantan SD dilakukan dengan beberapa modifikasi dari metode yang sudah ada . Secara singkat, pad lemak epididimis dari tikus diambil dalam kondisi steril, dicuci dengan larutan saline, dipotong kecil-kecil, dan diinkubasi pada suhu 37 C dengan kolagenase tipe I (17100017, Gibco, Gaithersburg, MD, USA). Jaringan yang dicerna disaring melalui saringan sel steril 100 m. Preadiposit primer yang terisolasi disuspensikan dalam media DMEM-F12 yang mengandung rosiglitazon sebelum pengujian dimulai.

 DIFERENSIASI ADIPOSIT DAN PEWARNAAN OIL RED O

Dua hari setelah sel mencapai konfluensi (hari 0), sel distimulasi dengan medium induksi IBMX, DEX, dan insulin (MDI cocktail) (media DMEM yang mengandung 10% FBS inaktif, 0,5 mM IBMX, 1 M/mL DEX, dan 1 g/mL insulin) dan diperlakukan dengan berbagai konsentrasi papain (6,25, 12,5, dan 25 g/mL). Tiga hari setelah stimulasi dengan MDI (hari 3), sel dikultur dalam medium insulin (media DMEM yang mengandung 10% FBS inaktif dan 1 g/mL insulin) dan diperlakukan dengan berbagai konsentrasi papain. Tiga hari kemudian (hari 6), sel dikultur dalam 10% FBS/DMEM dan diperlakukan dengan berbagai konsentrasi papain. Untuk adiposit primer tikus, digunakan medium MDI (media DMEM-F12 yang mengandung 5% FBS inaktif, 0,5 mM IBMX, 1 M/mL DEX, dan 5 g/mL insulin) dan medium insulin (media DMEM-F12 yang mengandung 5% FBS inaktif dan 5 g/mL insulin). Diferensiasi penuh tercapai pada hari ke-8. Sel yang terdiferensiasi difiksasi dalam formalin 10% selama 60 menit. Setelah itu, larutan fiksasi dibuang dan sel diinkubasi dalam larutan pewarna Oil Red O (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) selama 3 jam. Setelah itu, sel di-destain dengan isopropanol 40%. Oil Red O dielusi dengan menginkubasi sel dalam 1 mL isopropanol 100% selama 10 menit. Akumulasi lipid dalam sampel diukur dengan mengukur kepadatan optik menggunakan spektrofotometer pada 520 nm.

HASIL PENELITIAN PENURUNAN OBESITAS 

Papain Mengurangi Berat Hati dan Akumulasi Lipid Hati pada Mencit Obesitas yang Diinduksi HFD Untuk memeriksa efek papain terhadap akumulasi lipid hati, warna hati diamati, dan berat jaringan hati diukur pada setiap kelompok. Warna hati pada kelompok HFD terlihat kuning muda, sementara pada kelompok ND berwarna merah gelap, sedangkan warna hati kelompok HFD yang diberi perlakuan papain berubah menjadi merah gelap (Gambar 2a). Meskipun tidak ada perbedaan berat hati antara kelompok ND dan HFD pada minggu ke-9, mencit HFD yang diberi perlakuan papain menunjukkan penurunan berat hati yang signifikan dibandingkan dengan mencit yang diberi pakan HFD (Gambar 2b). Analisis histopatologis jaringan hati menunjukkan jumlah droplet lipid yang teridentifikasi secara mikroskopis lebih banyak dan akumulasi lipid yang lebih tinggi pada kelompok HFD dibandingkan dengan kelompok ND. Sementara itu, pemberian papain mengakibatkan penurunan yang nyata pada droplet lipid ini (Gambar 2c). Selain itu, pemberian papain pada mencit tidak menunjukkan efek toksik signifikan pada AST dan ALT, yang merupakan indikator sensitif kerusakan hati, yang menunjukkan bahwa papain menginduksi penurunan berat badan dan akumulasi lipid tanpa toksisitas pada mencit obesitas yang diinduksi HFD (Gambar 2d,e).

Pengaruh Papain terhadap Steatosis Hati pada Mencit Obesitas yang Diinduksi HFD (a) Analisis makroskopik jaringan hati mencit dari berbagai kelompok pada mencit yang mengalami obesitas akibat pakan HFD. (b) Berat hati pada mencit yang diberi pakan HFD. (c) Gambar histologis representatif jaringan hati yang dianalisis menggunakan pewarnaan H&E (perbesaran asli; 200). Jaringan hati dari mencit yang mewakili setiap kelompok difiksasi, dibenamkan dalam parafin, dan diwarnai dengan H&E. (d) Tingkat serum AST dan (e) ALT pada mencit obesitas yang diinduksi HFD

 Papain Mengatur Ekspresi Marker Adipogenik dan Inflamasi di Hati Mencit Obesitas yang Diinduksi HFD
Untuk menginvestigasi dasar molekuler dari efek anti-obesitas papain, ekspresi mRNA dan protein faktor transkripsi adipogenik diukur. Seperti yang terlihat pada Gambar 3a, ekspresi protein PPAR, C/EBP, dan SREBP-1 meningkat pada hati mencit yang diberi pakan HFD. Namun, perlakuan dengan papain secara signifikan menurunkan ekspresi protein marker tersebut di hati mencit HFD. Ekspresi mRNA PPAR, C/EBP, dan SREBP-1 juga berkurang setelah perlakuan papain pada mencit HFD (Gambar 3b). Diketahui bahwa jalur sinyal AMPK mengatur ekspresi faktor adipogenik [27]. Oleh karena itu, kami memeriksa apakah papain mempengaruhi aktivasi AMPK. Ekspresi protein AMPK yang terfosforilasi menurun pada kelompok HFD dibandingkan dengan kelompok ND, sementara setelah perlakuan papain, ekspresi tersebut meningkat secara signifikan .

Papain Mengurangi Berat Lemak Adiposa dan Menghambat Hipertrofi Adiposit pada Mencit Obesitas yang Diinduksi HFDJaringan adiposa putih adalah tempat utama penyimpanan lipid, dengan depot utama pada rodensia meliputi pad epididimal, visceral, dan mesenterik [28]. Oleh karena itu, kami mengukur rasio berat lemak epididimal terhadap berat badan dan rasio berat lemak visceral terhadap berat badan. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4a,b, rasio berat lemak epididimal dan visceral terhadap berat badan pada kelompok HFD meningkat hampir dua kali lipat dibandingkan dengan kelompok ND. Namun, perlakuan dengan papain secara signifikan mengurangi rasio berat lemak epididimal dan visceral terhadap berat badan dibandingkan dengan kelompok HFD. Analisis histologis menunjukkan bahwa adiposit pada jaringan lemak epididimal kelompok HFD lebih besar (111,0 11,06 m) dibandingkan dengan kelompok ND (64,1 9,95 m). Perlakuan papain secara nyata mengurangi pembesaran adiposit hingga tingkat yang serupa dengan kelompok ND (Gambar 4c). Hasil ini menunjukkan bahwa papain efektif dalam mencegah akumulasi lipid dan hipertrofi adiposit.

Papain Mengatur Adipokin dan Infiltrasi Makrofag dalam Jaringan Adiposa pada Mencit Obesitas yang Diinduksi HFD
Untuk memastikan peradangan pada jaringan adiposa mencit yang diberi pakan HFD, kami menilai ekspresi adipokin. Pemberian HFD menyebabkan peningkatan signifikan dalam ekspresi mRNA TNF-, IL-6, MCP-1, dan leptin. Namun, papain menurunkan tingkat ekspresi ini (Gambar 5a). Selain itu, kami mencatat penurunan ekspresi mRNA adiponektin pada mencit yang diberi pakan HFD dibandingkan dengan kelompok ND; meskipun demikian, ekspresi adiponektin meningkat setelah perlakuan papain, tetapi perbedaannya tidak signifikan (Gambar 5b). Ekspresi F4/80 menunjukkan peningkatan signifikan dengan tingkat infiltrasi makrofag yang lebih tinggi di sekitar adiposit pada jaringan adiposa mencit yang diberi pakan HFD dibandingkan dengan kelompok ND. Namun, infiltrasi makrofag ini berkurang dengan perlakuan papain (Gambar 5c,d). Hasil ini menunjukkan bahwa penurunan berat jaringan adiposa pada kelompok perlakuan papain dapat disebabkan oleh penghambatan akumulasi lipid dan hipertrofi adiposit akibat penurunan diferensiasi adiposit serta pengaturan respons inflamasi.

ISOLASI PAPAIN DARI POHON PEPAYA

Isolasi enzim papain dari pohon pepaya (Carica papaya) umumnya dilakukan dengan mengekstrak getah atau lateks dari pohon pepaya, yang mengandung enzim papain. Berikut adalah langkah-langkah umum untuk isolasi enzim papain dari pohon pepaya:

1. Persiapan Bahan dan Alat

• Bahan:
• 
  
  • Getah pepaya segar (lateks)
  • Air suling atau buffer fosfat (pH 7.0 - 8.0)
  • Larutan NaCl (jika diperlukan untuk mengekstraksi)
  • Bahan kimia seperti etanol atau asetat untuk mengendapkan enzim (opsional)
• Alat:
• 
  
  • Pisau atau pisau bedah untuk memotong batang atau daun pepaya
  • Wadah atau mangkuk untuk menampung getah
  • Kain kasa atau saringan untuk menyaring getah
  • Tabung reaksi atau wadah penyimpanan lainnya
  • Pipet dan mikropipet untuk pengambilan sampel

2. Pemanenan Getah Pepaya

• Potong batang atau daun pepaya yang masih muda dan sehat. Getah pepaya biasanya dapat diperoleh dengan membuat sayatan kecil pada batang atau daun.
• Setelah sayatan dibuat, getah akan keluar dalam bentuk cairan yang dapat ditampung dalam wadah bersih. Pastikan untuk mengambil getah yang masih segar dan tidak tercemar.

3. Ekstraksi Enzim Papain

• Setelah mendapatkan getah pepaya, ambil getah tersebut dan masukkan ke dalam wadah. Getah tersebut mengandung papain dalam jumlah yang cukup tinggi.
• Tambahkan sedikit air suling atau buffer fosfat (pH 7.0 - 8.0) untuk melarutkan enzim papain dari getah.
• Diamkan campuran tersebut selama beberapa menit agar enzim terlarut dengan baik dalam pelarut.

4. Filtrasi dan Penyaringan (1) Setelah beberapa waktu, saring campuran tersebut menggunakan kain kasa atau saringan untuk menghilangkan kotoran atau partikel besar dari getah yang mengandung papain. (2) Hasil filtrasi ini akan berupa larutan yang mengandung enzim papain yang siap digunakan.

5. Purifikasi, (1) Pengendapan dengan Asetat atau Etanol: Untuk mendapatkan enzim papain dalam bentuk yang lebih murni, dapat dilakukan proses pengendapan dengan menggunakan etanol atau asetat. Tambahkan pelarut ini ke dalam larutan getah pepaya, dan enzim papain akan terendapkan. (2) Pisahkan endapan tersebut dengan sentrifugasi atau filtrasi, dan dapatkan papain yang terisolasi.

6. Penentuan Aktivitas Enzim. Untuk mengetahui aktivitas papain dalam ekstrak, dilakukan uji aktivitas enzim menggunakan substrat protein seperti kasein atau gelatin, di mana papain akan memecah protein menjadi fragmen lebih kecil, yang kemudian dapat diukur.

7. Penyimpanan. Setelah papain diekstraksi, enzim ini dapat disimpan dalam wadah tertutup pada suhu rendah (misalnya dalam lemari es) untuk mempertahankan stabilitasnya, karena papain dapat kehilangan aktivitasnya jika disimpan pada suhu tinggi atau terpapar cahaya yang intens.

8. Penerapan. Enzim papain yang telah terisolasi ini bisa digunakan dalam berbagai aplikasi, baik untuk industri makanan (seperti sebagai pengempuk daging) maupun dalam bidang kesehatan untuk pengobatan atau pemanfaatan dalam kosmetik.

Catatan: Hasil isolasi papain sangat tergantung pada kesegaran getah yang digunakan dan kondisi ekstraksi yang tepat. Oleh karena itu, prosedur ini perlu dilakukan dengan hati-hati untuk meminimalkan degradasi enzim. Proses ini memungkinkan untuk mendapatkan enzim papain dalam bentuk yang cukup murni dan aktif untuk berbagai aplikasi.

KESIMPULAN 

 Papain adalah enzim proteolitik yang terdapat pada daun, buah, akar, dan getah dari tanaman Carica papaya (pepaya). Meskipun papain menunjukkan berbagai macam aktivitas, belum ada laporan mengenai efek anti-obesitas papain. Penelitian ini memeriksa efek anti-obesitas dan mekanisme anti-inflamasi yang terlibat dalam obesitas dari papain pada model in vivo dan in vitro menggunakan mencit obesitas yang diinduksi diet tinggi lemak (HFD) dan preadiposit 3T3-L1. Pemberian papain secara oral mengurangi berat badan, hati, dan jaringan adiposa mencit yang diinduksi HFD. Papain juga mengurangi akumulasi lipid di hati dan ukuran adiposit. Selain itu, tingkat kolesterol total dan trigliserida serum menurun secara signifikan pada mencit yang diberi papain. Selain itu, papain menghambat diferensiasi preadiposit dan akumulasi minyak pada preadiposit 3T3-L1 dan preadiposit primer tikus. Secara mekanistik, papain secara signifikan menurunkan tingkat protein regulator adipogenesis utama dan membalikkan ekspresi sitokin pro-inflamasi dan adipokin pada mencit obesitas yang diinduksi HFD dan preadiposit 3T3-L1. Papain juga secara signifikan meningkatkan aktivasi jalur protein kinase yang diaktifkan AMP (AMPK) pada kedua model tersebut. Secara keseluruhan, hasil-hasil ini menunjukkan bahwa papain memberikan efek anti-obesitas pada mencit yang diinduksi HFD dan preadiposit 3T3-L1 dengan mengatur kadar faktor adipogenik yang terlibat dalam metabolisme lipid dan peradangan; dengan demikian, papain dapat berguna dalam pencegahan dan pengobatan obesitas. Moga bermanfaat******

Reference

• Kang, Y. M., Kang, H. A., Cominguez, D. C., Kim, S. H., & An, H. J. (2021). Papain ameliorates lipid accumulation and inflammation in high-fat diet-induced obesity mice and 3T3-L1 adipocytes via AMPK activation. International journal of molecular sciences, 22(18), 9885.
• Choudhary, R., Kaushik, R., Chawla, P., & Manna, S. (2024). Exploring the extraction, functional properties, and industrial applications of papain from Carica papaya. Journal of the Science of Food and Agriculture.
• Novinec, M., & Lenari, B. (2013). Papain-like peptidases: structure, function, and evolution. Biomolecular concepts, 4(3), 287-308.
• Mudgil, P., Kamal, H., Yuen, G. C., & Maqsood, S. (2018). Characterization and identification of novel antidiabetic and anti-obesity peptides from camel milk protein hydrolysates. Food chemistry, 259, 46-54.