PEMERIKSAAN PROFIL LIPID SERUM
Sampel darah diambil dan disentrifugasi pada 1700 g selama 15 menit pada suhu ruang untuk memperoleh serum. Sampel yang tidak digunakan segera dibekukan pada 70 C untuk analisis selanjutnya. Kadar serum kolesterol total, AST, dan ALT diukur menggunakan metode enzimatik dengan kit komersial
ANALISIS REVERSE TRANSCRIPTION-QUANTITATIVE POLYMERASE CHAIN REACTION (RT-QPCR)
RNA total diisolasi dari jaringan hati, jaringan adiposa, atau sel menggunakan kit Easy Blue sesuai dengan prosedur yang diberikan oleh produsen. Kuantifikasi RNA total dilakukan menggunakan spektrofotometer volume mikro Epoch (BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA). cDNA diperoleh dengan menggunakan RNA total yang diisolasi (2 g), primer d(T)16, dan Avian Myeloblastosis Virus reverse transcriptase dengan penghilang DNA genomik. Ekspresi gen relatif dihitung menggunakan analisis RT-qPCR (Real Time PCR System 7500; Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA) dengan SYBR Premix Ex Taq. Perubahan lipatan ekspresi gen dihitung dengan metode siklus kuantifikasi komparatif. Nilai Cq dari gen target SREBP-1, PPAR, C/EBP, TNF-, IL-6, IL-1, MCP-1, leptin, adiponektin, FOXO1, SIRT1, AMPK, LKB1, dan CaMKK dinormalisasi terhadap GAPDH menggunakan program ABI Gene Express 2
ANALISIS WESTERN BLOT
Jaringan hati dan sel dihancurkan dalam larutan ekstraksi protein PRO-PREP dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu 4 C. Debris jaringan dihilangkan dengan sentrifugasi mikro pada 11.000 g selama 15 menit, dan supernatan dibekukan dengan cepat. Konsentrasi protein diukur menggunakan reagen uji protein Bio-Rad sesuai instruksi dari produsen (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Protein dipindahkan ke membran poliviniliden difluorida (PVDF) setelah pemisahan pada gel poliakrilamida SDS 10%--12%. Membran diinkubasi selama 1 jam dengan larutan blokir (5% susu skim) pada suhu ruang, kemudian diinkubasi semalam dengan antibodi primer pada suhu 4 C. Blot dicuci tiga kali dengan Tween 20/Tris-buffered saline (T/TBS) dan diinubasi dengan antibodi sekunder terkonjugasi peroksidase lobak (pengenceran 1:2500) selama 2 jam pada suhu ruang. Setelah dicuci tiga kali lagi dengan T/TBS, blot dikembangkan menggunakan reagen kemiluminesensi yang diperkuat (GE Healthcare, Waukesha, WI, USA).
 ANALISIS IMUNOHISTOKIMIA (IHC)
 Jaringan adiposa difiksasi dengan formalin terbuffer 10%, dibenamkan dalam parafin, dipotong setebal 4 m, dan dilakukan pewarnaan IHC. Setelah proses pembenaman parafin, potongan jaringan dicuci dengan xilena, direhidrasi dalam etanol, dan dilanjutkan dengan perawatan air. Aktivitas peroksidase endogen diblokir dengan 0,6% H2O2 dalam 50% metanol, lalu slide dirawat dengan 0,3% Triton dalam PBS untuk permeabilisasi dan diblokir dengan serum kambing normal 10% selama 1 jam, sebelum inkubasi semalam dengan antibodi spesifik untuk F4/80 pada suhu 4 C. Potongan jaringan kemudian dicuci dan diinubasi dengan antibodi sekunder terkonjugasi peroksidase lobak selama 1 jam pada suhu ruang. Aktivitas visualisasi dilakukan dengan kromogen DAB dan pewarnaan balik dilakukan dengan H&E. Perubahan patologis pada seluruh potongan jaringan yang diwarnai diamati menggunakan mikroskop DM IL LED (Leica, Wetzlar, Jerman) dan difoto menggunakan DFC295 (Leica, Wetzlar, Jerman). Gambar digital diambil dari setiap slide (dua per kelompok) dan diukur menggunakan Leica Application Suite (Leica, Wetzlar, Jerman).
 KULTUR PREADIPOSIT 3T3-L1 DAN UJI VIABILITAS SEL
Preadiposit 3T3-L1 diperoleh dari American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Preadiposit 3T3-L1 tikus dikultur dalam DMEM yang mengandung 10% BS, 100 unit/mL penisilin, dan 100 g/mL streptomisin pada suhu 37 C dengan 5% CO2. Viabilitas sel dievaluasi menggunakan uji MTT. Secara singkat, sel diperlakukan dengan masing-masing sampel dan diinkubasi selama 24 jam, kemudian diinubasi dengan larutan MTT (5 mg/mL) selama 4 jam pada 37 C. Setelah membuang supernatan, produk formazan yang terbentuk dilarutkan dalam DMSO. Viabilitas sel diukur pada 540 nm menggunakan pembaca mikrotiter (Titertek Multiskan, Huntsville, AL, USA).
 ISOLASI PREADIPOSIT PRIMER TIKUS
