Mengenal dari Dekat Enzim Amilase

 AMILASE BAKTERI

Di antara berbagai spesies mikroba yang mengeluarkan amilase, produksinya dari bakteri lebih murah dan lebih cepat dibandingkan dari mikroorganisme lain. Selain itu, seperti disebutkan di atas, studi rekayasa genetika lebih mudah dilakukan dengan bakteri dan juga sangat cocok untuk produksi enzim rekombinan. Berbagai macam spesies bakteri telah diisolasi untuk sekresi amilase. Kebanyakan merupakan spesies Bacillus (B. subtilis, B. stearothermophilus, B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. coagulans, B. polymyxa, B. mesentericus, B. vulgaris, B. megaterium, B. cereus, B. halodurans, dan Bacillus sp. Ferdowsicous), tetapi amilase dari Rhodothermus marinus, Corynebacterium gigantea, Chromohalobacter sp., Caldimonas taiwanensis, Geobacillus thermoleovorans, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus manihotivorans, dan Pseudomonas stutzeri juga telah diisolasi.

 Strain halofilik yang menghasilkan amilase antara lain Haloarcula hispanica, Halobacillus sp., Chromohalobacter sp., Bacillus dipsosauri, dan Halomonas meridiana . Lebih banyak penelitian yang melibatkan isolasi dan perbaikan strain baru akan membuka jalan untuk menciptakan strain yang penting. Misalnya, Dash dkk.  mengidentifikasi strain B. subtilis BI19 baru yang menghasilkan amilase secara efisien dan, setelah mengoptimalkan kondisi, meningkatkan produksi enzim sekitar 3,06 kali lipat. Analisis struktur tiga dimensi dari amilase tersebut membantu meningkatkan efisiensinya. Misalnya, struktur kristal -amilase dari Anoxybacillus telah memberikan wawasan tentang subkelas enzim ini . Studi tentang struktur tiga dimensi juga membantu perubahan atau mutasi asam amino tertentu untuk meningkatkan efisiensi dan fungsi enzim atau protein.

 AMILASE JAMUR

Enzim jamur mempunyai keuntungan karena disekresi secara ekstraseluler. Selain itu, kemampuan jamur untuk menembus substrat keras memudahkan proses hidrolisis. Selain itu, spesies jamur sangat cocok untuk fermentasi berbahan padat. Amilase pertama yang diproduksi oleh jamur untuk aplikasi industri telah dijelaskan beberapa dekade yang lalu. Spesies penghasil amilase yang efisien mencakup spesies dari genus Aspergillus (A. oryzae, A. niger, A. awamori, A. fumigatus, A. kawachii, dan A. flavus), serta spesies Penicillium (P. brunneum, P. fallutanum , P. expansum, P. chrysogenum, P. roqueforti, P. janthinellum, P. camemberti, dan P. olsonii), Streptomyces rimosus, Thermomyces lanuginosus, Pycnoporus sanguineus, Cryptococcus flavus, Thermomonospora curvata, dan Mucor sp.

 AMILASE REKOMBINAN

Rekayasa genetika dan teknologi DNA rekombinan adalah teknik molekuler saat ini yang digunakan untuk meningkatkan produksi enzim yang efisien.Teknologi DNA rekombinan untuk produksi amilase melibatkan pemilihan gen amilase yang efisien, penyisipan gen ke dalam sistem vektor yang sesuai, transformasi dalam sistem bakteri yang efisien untuk menghasilkan protein rekombinan dalam jumlah besar (dengan adanya agen penginduksi promotor vektor ekspresi ), dan pemurnian protein untuk aplikasi hilir . Dalam teknologi ini, jumlah salinan gen yang tinggi mendorong hasil amilase yang lebih tinggi. 

Di sisi lain, penyaringan perpustakaan mutan untuk pemilihan varian mutan terbaik untuk produksi amilase rekombinan telah lebih berhasil.  Zhang dkk. menghapus amyR (pengkodean faktor transkripsi) dari A. niger CICC2462, yang menyebabkan produksi enzim/protein secara spesifik dengan sekresi protein latar belakang yang lebih rendah. Wang dkk.  menghasilkan strategi baru untuk mengekspresikan -amilase dari Pyrococcus furiosus di B. amyloliquefaciens. Enzim termostabil ekstraseluler ini diproduksi dalam jumlah rendah di P. furiosus, namun ekspresinya di B. amyloliquefaciens meningkat secara signifikan dan memiliki stabilitas yang baik pada suhu yang lebih tinggi (optimal 100C) dan pH lebih rendah (pH optimal 5). Dengan meniru sistem P. furiosus, mereka memperoleh amilase baru dengan hasil ~3000 dan 14 kali lipat unit amilase/mililiter lebih tinggi dibandingkan yang diproduksi di B. subtilis dan Escherichia coli.

BAGAIMANAKAH SKRINING PRODUKSI MIKROBA AMILASE DILAKUKAN?

Produksi atau sekresi amilase dapat disaring dengan berbagai metode umum, termasuk teknik berbasis padat atau berbasis larutan. Metode berbasis padat dilakukan pada pelat agar nutrien yang mengandung pati sebagai substrat, sedangkan metode berbasis larutan meliputi teknik dinitro salicylic acid (DNS) dan Nelson-Somogyi (NS). Dalam metode agar padat, strain yang sesuai (jamur atau bakteri) diinokulasikan secara tepat pada agar yang mengandung pati di tengah cawan Petri. Setelah masa inkubasi yang sesuai, pelat dibanjiri dengan larutan yodium, yang menunjukkan warna gelap kebiruan pada daerah substrat dan daerah bening (akibat hidrolisis) di sekitar inokulum, menunjukkan pemanfaatan pati oleh mikroba amilase. Gopinath dkk.  menerapkan metode ini untuk menentukan aktivitas amilase Aspergillus versicolor, serta Penicillium sp., dalam studi pendahuluannya.

Produksi amilase pada cawan petri yang berisi media  agar. Dalam metode berbasis padat ini, media agar cawan petri  yang mengandung pati diinokulasi dengan tepat dengan mikroorganisme di tengah cawan Petri. Setelah masa inkubasi yang sesuai, pelat yang dibanjiri dengan larutan yodium akan menunjukkan warna kebiruan gelap pada daerah substrat. Daerah bening di sekitar inokulum menunjukkan zona hidrolisis. (a) Aktivitas amilolitik oleh Aspergillus versicolor; (b) aktivitas amilolitik oleh Penicillium sp.