Mengisolasi Lipase dari Bakteri yang Hidup di Laut

Katalis 10 01032 g002 550Gambar 2. Gambaran umum struktur tiga dimensi dari dua lipase mikroba. (A) Struktur kristalografi lipase Candida rugosa dengan lipatan /-hidrolase berwarna abu-abu menunjukkan tutup dalam konformasi terbuka (nomor akses PDB 1CRL) dan /-hidrolase dalam warna gandum menunjukkan tutup dalam konformasi tertutup (Nomor akses PDB 1TRH). (B) Struktur kristalografi lipase Rhizomucor miehei dengan lipatan /-hidrolase berwarna abu-abu menunjukkan tutup dalam konformasi terbuka (nomor akses PDB 4TGL) dan lipatan /-hidrolase dalam warna sian menunjukkan tutup dalam konformasi tertutup ( Nomor akses PDB 3TGL). Tutup di kedua struktur berwarna merah. Semua gambar disiapkan menggunakan perangkat lunak visualisasi molekuler, PYMOL.

Mekanisme katalitik lipase didasarkan pada triad katalitik yang terdiri dari asam amino nukleofil (Ser), asam (Asp atau Glu), dan His. Triad katalitik yang mengandung Asp dikenal dalam enzim, seperti protease. Menariknya, berbeda dari lipase dan protease serin lainnya, triad katalitik dari lipase G. candidum adalah Ser-His-Giu, dengan asam glutamat menggantikan aspartat umum.

 Residu nukleofil pusat terletak dalam motif Glu-X-Ser-X-Glu yang dilestarikan. Lubang oksianion adalah komponen penting lainnya yang terlibat dalam efisiensi katalitik enzim ini, karena membantu menstabilkan keadaan transisi dalam katalisis. Selama proses katalitik, zat antara tetrahedral bermuatan negatif dihasilkan, dan ion oksigen yang terbentuk distabilkan oleh asam amino lubang oksianion. Residu lubang oksianion memainkan peran penting dalam menstabilkan oksigen ini melalui ikatan hidrogen. 

Daerah katalitik lipase memiliki salah satu residu lubang oksianion yang diposisikan berdekatan dengan serin asam amino nukleofil, sedangkan residu kedua terletak di antara untai 3 dan heliks  Lipase juga memiliki struktur seperti penutup atau penutup, yang terdiri dari satu atau lebih heliks dengan panjang yang bervariasi. Kantung pengikat lipase terdapat pada lembaran pusat, yang dapat berupa tempat pengikatan hidrofobik seperti celah yang terletak di dekat permukaan protein atau tempat pengikatan seperti corong atau terowongan. Domain tutup melibatkan interaksi spesifik dengan substrat dan mengontrol keseimbangan enzim bentuk tidak aktif/aktif .

 REKAYASA PROTEIN LIPASE

Rekayasa protein adalah proses penyesuaian enzim baru dengan fitur yang ditingkatkan dengan mengubah urutan asam amino primernya. Mengingat banyaknya kemungkinan perubahan, prosedur ini telah menghasilkan hasil yang luar biasa dalam desain lipase optimal yang digunakan di kawasan industri penting. Strategi rekayasa protein, seperti desain rasional dan evolusi terarah telah memberikan hasil menarik dalam peningkatan lipase yang berbeda.

Rekayasa protein dengan desain rasional menggunakan pengetahuan sebelumnya tentang struktur protein dan pendekatan pemodelan komputasi mendalam untuk merancang biokatalis baru dengan sengaja.

Sebagian, jumlah struktur lipase yang disimpan di Bank Data Protein (PDB, https://www.rcsb.org/) dan informasi urutan lipase di berbagai database telah secara substansial memfasilitasi desain rasional protein ini. Selain itu, berbagai jenis perangkat lunak pemodelan telah dibuat, yang membuat metodologi ini lebih mudah digunakan dan meningkatkan tingkat keberhasilan prediksi pemodelan. Biasanya, informasi yang diperoleh dari pemodelan komputer mengidentifikasi asam amino tertentu (hot-spot) yang harus diubah untuk menyebabkan perubahan pada sifat lipase. 

Dengan menggunakan prediksi komputasi, Mohammadi et al. membuat empat mutan lipase S. marcescens. Mutan MutG2P dan MutG59P menunjukkan efisiensi katalitik dan stabilitas termal yang lebih tinggi dibandingkan enzim tipe liar (WT). Selain itu, pendekatan komputasi lain telah dikembangkan untuk memprediksi efek mutasi pada lipase. Li dkk.  menggunakan strategi yang dinotasikan sebagai RIF yang terdiri dari tiga metode komputasi---yaitu, monomer Rosetta ddg, I Mutant 3.0, dan FoldX---untuk merancang dan mengoptimalkan stabilitas termal lipase R. miehei secara rasional.

Perilaku dinamis lipase dalam kondisi berbeda juga telah diselidiki menggunakan pendekatan komputasi, seperti simulasi dinamika molekuler (MD). Simulasi MD telah membuat kemajuan dalam arah ini karena memberikan informasi atomistik tentang interaksi molekul dinamis, yang menentukan stabilitas dan fungsi protein . Haque dan Prabhu melakukan simulasi MD lipase pankreas babi mutan dalam konformasi terbuka dan tertutup menggunakan pelarut berbeda untuk menjelaskan dinamika pembukaan kelopak mata. Pada suhu yang lebih tinggi, pembukaan tutup dapat diamati oleh mutan Asp250Val dan Glu254Leu, menunjukkan peran penting residu ini dalam menjaga tutup dalam konformasi tertutup, yang dapat mempengaruhi aktivitas enzim ini. 

Skema desain komputasi berdasarkan simulasi MD juga diterapkan untuk meningkatkan stabilitas termal lipase LIP2 dari Y. lipolytica Berdasarkan empat parameter struktur RMSD, Rg, SASA dan jumlah ikatan hidrogen internal, ditemukan bahwa mutan V213P akan memiliki stabilitas termal yang lebih tinggi dibandingkan induk WT-nya. V213P juga memiliki suhu optimal 42 C, 5.0 C lebih tinggi dibandingkan tipe liar.