Destilasi merupakan proses untuk memisahkan etanol dari hasil sampingannya seperti air. Jadi, setelah proses fermentasi selesai, larutan fermentasi dimasukkan ke dalam alat penguap (evaporator) dengan suhu 79-81 C. Pada suhu ini etanol sudah menguap, namun air tidak menguap. Uap etanol dialirkan ke distilator. Uap etanol yang dihasilkan dikumpulkan dan dikondensasikan menjadi bentuk cair kembali. Bioetanol akan keluar dari pipa pengeluaran distilator. Destilasi pertama, biasanya kadar etanol masih di bawah 95 %. Jika kadarnya masih di bawah 95 %, distilasi perlu diulangi lagi, istilahnya destilasi bertingkat hingga kadar etanolnya 95 %.
F. Tahap Dehidrasi/Pemurnian/Pengeringan
Kadar etanol yang sudah 95 % tersebut dilakukan dehidrasi atau penghilangan air dengan menambahkan kapur tohor atau zeolite sintesis. Bahan ini mampu menyerap atau menarik air yang terdapat dalam Bioetanol. Biarkan semalam hingga dihasilkan etanol murni atau etanol kering dengan kadar 99,5 %.
Mengolah Ampas Tebu Menjadi Bioetanol
Ampas tebu merupakan produk samping utama  yang dihasilkan selama proses pembuatan Bioetanol dari tebu. Ampas tebu mengandung selulosa yang dapat diuraikan atau dihidrolisis menjadi pati dan selanjutnya menjadi glukosa. Cara yang digunakan untuk mengolah ampas tebu menjadi bioethanol adalah dengan proses Organosolv yang menggunakan asam encer untuk hidrolisis. Cara ini telah dilakukan untuk memproduksi bioethanol sebanyak 5000 Liter per hari di Brazil.
1. Haluskan ampas tebu sehingga ukurannya sama.
2. Keringkan dengan oven selama satu jam pada suhu 60-70 C. Kadar air maksimal setelah pengeringan ini sekitar 10 %.
3. Simpan ampas tebu ditempat kering.
4. Timbang berat ampas tebu yang telah kering.
