Metode kedua melibatkan jalur konversi independen CoA [10]. Dalam jalur metabolisme ini, asam ferulic pertama-tama menghilangkan gugus karboksil untuk menghasilkan 4-vinilguaiacol di bawah katalisis ferulic decarboxylase Fdc dan kemudian menghasilkan vanillin di bawah katalisis 4-vinylguaiacol oksigenase Cso2. Mekanisme ketiga melibatkan proses biokonversi dua langkah. Pada langkah pertama, Aspergillus niger mengubah asam ferulat menjadi asam vanilat, dan pada langkah kedua, asam vanilat direduksi menjadi vanillin oleh Pycnoporus cinnabarinus. Meskipun proses biotransformasi ini telah dilaporkan, enzim fungsional spesifik yang terlibat dalam proses transformasi ini masih belum diketahui. Metode keempat adalah jalur sintetik satu langkah yang hanya ditemukan pada sel tumbuhan. Pada jalur ini, asam ferulic dapat langsung menghasilkan vanillin melalui katalisis kontinyu vanillin sintase VpVAN.
Dalam kebanyakan kasus, biotransformasi asam ferulat menggunakan mikroba melibatkan jalur terkenal yang bergantung pada koenzim A dan non--oksidatif dari asam ferulat menjadi feruloyl-CoA dan feruloyl-CoA menjadi vanilin, yang dikatalisis menggunakan feruloyl-CoA synthetase ( Fcs) dan enoyl-CoA hidratase/aldolase (Ech), masing-masing. Proses metabolisme dua langkah ini terutama melibatkan gen fcs dan ech dan memerlukan partisipasi CoASH, ATP, dan MgCl2
 OPTIMASI PROSES
Karena vanilin beracun bagi mikroba, sulit untuk mengakumulasi vanillin konsentrasi tinggi melalui jalur mikroba langsung, terutama untuk budidaya jangka panjang. Beberapa strategi optimasi telah dilaporkan:
 (1) Optimasi komposisi medium dan desain reaktor melibatkan proses konversi dua pot vanilin berdasarkan asam ferulat. Penambahan FeCl2 ke dalam medium meningkatkan aktivitas Cso2 dalam E. coli rekombinan, memfasilitasi konversi 4-vinil guaiacol menjadi vanillin pada tahap kedua dan mengembangkan teknik imobilisasi untuk dua enzim utama (Fdc dan Cso2) selama dua- proses konversi pot tahap. Katalis Cso2 yang diimobilisasi ini memungkinkan produksi 6,8 mg vanillin dari isoeugenol melalui sepuluh siklus reaksi pada skala 1 mL.
(2) Strategi lainnya adalah penyaringan atau konstruksi genetik dari strain yang lebih kuat. Misalnya, pengenalan gen sintase polihidroksibutirat (PHB) atau siklopropana-asam lemak-asil-fosfolipid ke dalam E. coli dapat meningkatkan toleransi sel terhadap vanillin (laju pertumbuhan strain rekayasa masing-masing adalah 2 kali dan 3,3 kali lebih tinggi dari strain aslinya).
 Selain itu, ditemukan bahwa ekspresi berlebih dari gen reduktase dan dehidrogenase spesifik, misalnya alkohol dehidrogenase, asetaldehida dehidrogenase, dan aldehida reduktase yang bergantung pada NADH, dapat meningkatkan toleransi S. cerevisiae terhadap vanillin.
(3) Metode ini melibatkan pengurangan akumulasi vanilin dalam media kultur dan toksisitas vanilin, yang mengarah pada produksi sel. Dalam studi eksperimental, penggunaan adsorben untuk mengikat vanilin merupakan solusi yang efektif. Misalnya, membran sol-gel kitosan yang digunakan untuk mengurangi penghambatan produk vanilin dikombinasikan dengan sel E. coli yang direkayasa, dan konsentrasi akhir vanilin mencapai 4,5 g/L (tingkat konversi sekitar 75%) . Selain itu, sistem bioreaktor partisi dua fase padat-cair (TPPB) digunakan sebagai teknik penghilangan produk in situ untuk meningkatkan produktivitas transformasi strain ini.
Menggunakan Hytrel G4078W sebagai fase sequestering, konsentrasi akhir vanilin sebesar 19,5 g/L diproduksi dalam mode TPPB fed-batch padat-cair. Selain itu, strategi multi-pulse-feeding diterapkan untuk mengatasi akumulasi racun vanilin dalam kaldu fermentasi melalui sentrifugasi bertahap, yang menghasilkan peningkatan produktivitas volumetrik vanilin sebesar 64% (0,46 g L1h1) dibandingkan dengan teknik pengumpanan pulsa tunggal (0,29 g L1h1)
 (4) Gunakan strategi katalisis sel istirahat. Karena sel kekurangan beberapa nutrisi penting, mikroba yang tersisa tidak dapat berkembang biak. Namun, berbagai sistem enzim di dalam sel masih dapat memfermentasi nutrisi lain dan memiliki kapasitas yang tinggi untuk menghasilkan produk. Sel istirahat telah lama digunakan dalam produksi vanilin karena waktu reaksinya yang cepat, bioakumulasi yang tinggi, kesederhanaan pemisahan produk, dan pengaruh yang lebih kecil terhadap akumulasi substrat beracun [4,31,32,62,75,85]. Ditemukan bahwa sel Pseudomonas fluorescens BF13-1p4 (pBB1) dapat mensintesis vanilin tanpa produk sampingan yang tidak diinginkan dan beracun (seperti vanilin alkohol, asam protocatechuic, dan protocatechuic aldehyde) menggunakan strategi sel istirahat, yang juga merupakan salah satu dari sedikit strategi ideal. kondisi untuk produksi vanilin karena sepenuhnya bebas dari produk sampingan lainnya.
REKAYASA HILIR: PEMULIHAN VANILLIN
