Apa itu Fluorescence? Part 1

Apa itu Fluoresensi?

1.1 Kapan Anda merasa 'excited'? (Spektrum eksitasi) 

Silakan nilai rasa excited Anda pada adegan berikut.
1) Naik roller coaster.
2) Mengemudi melewati celah gunung.
3) Menonton pertandingan sepak bola di stadion.

Kita coba untuk mengambil jawaban pada 3 responden (Tabel 1), Orang A, B, dan C menjawab pertanyaan-pertanyaan tersebut sebagai berikut.

Ini menunjukkan karakter A, B, dan C dengan baik, bukan?

Secara umum, dapat dikatakan bahwa setiap orang lebih mudah gembira dengan berbagai jenis stimulasi.
Bagaimana seseorang dapat diketahui sedang gembira? Jawabannya sederhana. Berbagai fenomena, seperti detak jantung meningkat, berkeringat, tampak memerah, menangis, dan berteriak muncul saat seseorang gembira. Cukup dengan mengamati salah satu saja dari fenomena tersebut.

Sekarang, mari kita ubah pokok bahasan ke fluorofotometri yang sebenarnya.
Spesimen yang ditangani dengan fluorofotometri terlalu tereksitasi oleh stimulan. Spesimen (material) yang berbeda tereksitasi oleh stimulan yang sangat berbeda. Spesimen yang tereksitasi menunjukkan berbagai fenomena yang membuktikan bahwa mereka benar tereksitasi.
Misalnya, mereka memancarkan cahaya. Jika mereka memancarkan cahaya dengan kuat, itu berarti mereka sangat 'excited', tetapi jika mereka memancarkan cahaya dengan lemah, itu berarti mereka hanya sedikit 'excited'.

By the way, apa sumber stimulasi untuk spesimen? Dalam metode fluoroskopi, penyinaran cahaya digunakan sebagai sarana untuk menstimulasi spesimen. Stimulasi bervariasi dengan mengubah panjang gelombang (warna) cahaya yang disinari.

Sebagai contoh, kita beri nilai tingkat 'excitement' (intensitas pendaran cahaya) setiap spesimen dalam scene berikut.
1) Terkena cahaya ungu.

2) Terkena cahaya biru.

3) Terkena cahaya hijau.

intensitas pendaran cahaya untuk  Spesimen A, B, dan C (Tabel 2) adalah sebagai berikut.

Tabel 2. Intensitas pendaran cahaya tiap spesimen

Ini memperlihatkan karakter Spesimen A, B, dan C dengan baik, bukan?

Secara umum, spesimen yang ditangani dengan fluorofotometri akan tereksitasi (memancarkan) cahaya saat terkena cahaya. Namun, dapat dikatakan bahwa spesimen yang berbeda lebih mungkin tereksitasi (memancarkan) cahaya dengan panjang gelombang yang berbeda. Kita dapat melihat karakter spesimen tertentu dengan mengamati emisinya saat disinari dengan cahaya dengan panjang gelombang yang berbeda.

Dengan mata kita, kita dapat membedakan cahaya eksitasi hanya dengan menggunakan nama-nama warna seperti ungu, biru, dan hijau. Dalam fluorofotometri dan analisis spektral, warna-warna cahaya ini dibedakan berdasarkan panjang gelombang (satuan: nm, nanometer, 1 nm = 1 / miliar m). Meskipun sangat bergantung pada mata pengamat, dikatakan bahwa cukup mengamati satu fenomena saja untuk mengonfirmasi eksitasi yang disebutkan di bagian sebelumnya.

Ungu: 400 - 420 nm
Biru: 450 - 500 nm
Hijau: 500 - 550 nm

Bentuk spektrum eksitasi umum adalah sebagai berikut (Gambar 1). Spesimen yang diilustrasikan memancarkan fluoresensi paling kuat saat tereksitasi (terstimulasi) oleh cahaya pada 400 nm  dan juga memancarkan fluoresensi secara signifikan, meskipun lebih sedikit saat tereksitasi dengan cahaya eksitasi 350 nm. 

Gambar 1.  Contoh Spektrum Eksitasi/dokpri

1.2 Bagaimana jika ada banyak klon manusia? (Pengukuran kuantitatif)

Skenario berikutnya berasal dari fiksi ilmiah. Misalkan ada banyak klon manusia (manusia yang diduplikasi). Katakanlah 100 klon dibuat dari seseorang yang akan berteriak tanpa sadar saat bersemangat (Gambar 2). Apa yang terjadi jika klon-klon tersebut dikumpulkan dalam satu ruangan dan distimulasi untuk bersemangat?
Jika mereka adalah klon yang sempurna, teriakan yang 100 kali lebih keras dari teriakan satu orang akan bergema di seluruh ruangan.
Jika kerasnya teriakan satu orang diukur sebelumnya, dan stimulasi diberikan di ruangan yang jumlah klonnya tidak diketahui, jumlah klon di ruangan tersebut dapat diketahui dengan mengukur total kerasnya teriakan.

Gambar 2. Ilustrasi Klon manusia/dokpri

Pengukuran kuantitatif yang mengukur konsentrasi spesimen dengan metode fluoroskopi sangat mirip dengan ini.
Jika ada beberapa spesimen dengan komponen yang sama di mana hanya konsentrasinya yang bervariasi, intensitas fluoresensi menjadi kecil (untuk teriakan, volume suara kecil) jika spesimennya encer (dalam kasus klon manusia, hanya ada sedikit), dan intensitas fluoresensi menjadi besar (volume suara lebih besar) jika spesimennya padat (jika jumlahnya banyak).

Tabel 3. Data perbandingan konsentrasi dan Intensitas

Seperangkat spesimen (sampel standar) dengan konsentrasi yang diketahui disiapkan untuk mengukur intensitas fluoresensinya. Hasilnya diplot untuk memperoleh kurva kalibrasi. Setelah kurva kalibrasi diperoleh, spesimen dengan konsentrasi yang tidak diketahui dapat diukur.
Misalnya, intensitas fluoresensi spesimen adalah 40. Dengan merujuk pada kurva kalibrasi yang ditunjukkan pada (Gambar 3) sebelah kanan, konsentrasi spesimen dapat diperkirakan sebesar 16 ppm.

Gambar 3. Kurva Kalibrasi/dokpri

Kisaran konsentrasi apa yang sebenarnya dapat diukur?
Berdasarkan teori yang dijelaskan di atas, tampaknya adalah mungkin untuk mengukur bahkan spesimen yang paling pekat, tetapi itu tidak benar. Jika spesimen terlalu padat, fluoresensi yang dipancarkan dari bagian tertentu dari sel sampel dapat diserap oleh sekelilingnya (yang dapat mendistorsi bentuk spektrum eksitasi/fluoresensi), atau cahaya eksitasi mungkin tidak mencapai cukup dalam ke dalam sel sampel, yang menyebabkan penurunan fluoresensi. Tentu saja, jika terlalu encer, fluoresensi akan terlalu lemah untuk dideteksi. Dalam kedua kasus, kisaran konsentrasi yang dapat diukur sangat bergantung pada objek yang diukur.

Ilustrasi Fluoresensi