Lalu, faktor kedua yang mempengaruhi keberhasilan metode kultur jaringan adalah media kultur. Unsur penting dalam media kultur adalah vitamin, garam anorganik, sumber energi, zat pengatur tumbuh, serta karbon. Garam anorganik yang digunakan terdiri dari unsur hara yang esensial, serta karbohidrat yang umumnya berupa gula.
Faktor ketiga yang mempengaruhi keberhasilannya adalah zat pengatur tumbuh tanaman (ZPT). Zat pengatur tumbuh adalah senyawa organik bukan nutrisi yang dalam jumlah sedikit (<1 milimole (mM)) mampu memacu, menghambat atau mengubah proses fisiologi tanaman (Moore, 1979). ZPT berpengaruh dalam morfogenesis dan pertumbuhan dalam kultur sel, jaringan, dan organ.
Tahap-tahap yang dilakukan pada saat melakukan metode kultur jaringan adalah tahap inisiasi, tahap multiplikasi, tahap perakaran, dan tahap aklimatisasi. Tahap yang pertama adalah tahap inisiasi, dimana tahap ini bertujuan untuk memperoleh eksplan yang bebas dari mikroorganisme dan inisiasi pertumbuhan baru.
Tahap yang kedua adalah tahap multiplikasi atau biasa disebut tahap perbanyakan, dimana pada tahap ini tunas yang tumbuh dari hasil induksi diperbanyak dengan cara dipotong setiap ruasnya dan ditanam pada media perbanyakan. Media perbanyakan ini pada umumnya lebih banyak mengandung sitokinin.
Sitokinin adalah suatu senyawa yang mengatur pertumbuhan dan perkembangan tanaman, serta mampu meningkatkan pembelahan sel pada jaringan tumbuhan. Sitokinin ini sangat berperan dalam diferensiasi, pembelahan, dan perpanjangan sel, serta pembentukan organ. Dalam medium kultur jaringan, pemberian sitokinin ini sangat penting untuk menginduksi tumbuh kembang eksplan.
Tahap yang ketiga adalah tahap perakaran, dimana tahap ini bertujuan untuk membentuk akar dan plantlet yang mandiri serta membentuk pucuk tanaman yang kuat untuk bertahan hidup sampai ketika dipindahkan dari lingkungan in-vitro ke lingkungan alamiahnya. Tunas yang dihasilkan dari tahap multiplikasi yang belum memiliki akar kemudian dipindahkan ke media yang mengandung lebih banyak auksin.
Auksin adalah hormon yang berperan dalam mempercepat tumbuhnya tanaman dengan cara merangsang pembelahan dan pembesaran sel, serta dengan berinteraksi dengan hormon lainnya.
Tahapan yang keempat serta merupakan yang terakhir adalah tahap aklimatisasi, yang merupakan tahapan suatu organisme untuk beradaptasi dengan lingkungannya yang baru.Â
Plantlet hasil kultur jaringan sering masih terasa sulit untuk dipelihara dengan kondisi lingkungan alamiahnya karena masih sangat peka, sehingga dibutuhkan tahap adaptasi atau aklimatisasi tersebut. Proses adaptasi ini bisa dibilang sangat penting dan merupakan kunci penentu apakah tanaman yang berasal dari in-vitro dapat beradaptasi atau tidak dapat beradaptasi dalam kondisi in-vivo.Â
Dalam tahap ini, dilakukan pemindahan eksplan dari ruangan aseptik ke rumah kaca. Pemindahan ini dilakukan secara berhati-hati dan bertahap, dengan cara memberikan sungkup untuk melindungi bibit yang masih sangat rentan akan serangan hama penyakit serta udara di luar.Â
Setelah nantinya bibit dapat beradaptasi dengan lingkungan luar, maka sungkup akan dilepas secara bertahap, dan pemeliharaan bibit akan dilakukan seperti pemeliharaan bibit generatif.
