Teknik Enumerasi

Tujuan

Untuk mengetahui cara menghitung bakteri secara langsung

Untuk mengetahui cara menghitung bakteri secara tidak langsung

Dapat membedakan mana kolon dan sel

Dapat melakukan enumerasi mikroba pada bahan melalui metode...dengan baik dan benar

Dasar teori

Enumerasi bakteri adalah teknik perhitungan jumlah mikroba dalam suatu media tanpa mengidentifikasi jenis mikroba (bakteri, jamur, yeast) yang bertujuan untuk menentukan jumlah sel dari suatu kultur bakteri secara kuantitatif. Penetapan jumlah bakteri dilakukan dengan menghitung jumlah sel bakteri yang mampu membentuk koloni di dalam media biakan atau membentuk suspen sedalam larutan biak. Enumerasi mikroorganisme dapat dilakukan secara langsung maupun tidak langsung. Metode yang digunakan untuk menghitung mikroba secara langsung di antaranya adalah Counting chamber, cara pengecatan dan pengamatan mikroskopik, serta filter membrane. Penghitungan secara langsung dapat dilakukan secara mikroskopis yaitu dengan menghitung jumlah bakteri dalam satuan isi yang sangat kecil. Alat yang digunakan adalah Chamber atau Haemocytometer (Brown, 2005).

Perhitungan mikroba dengan metode enumerasi dalam suatu media dilakukan tanpa identifikasi jenis mikroba. Hal ini bertujuan untuk mengestimasi jumlah sel dari suatu kultur bakteri secara kuantitatif (Garg dkk., 2010).

Pengukuran kuantitatif populasi mikroorganisme sangat diperlukan untuk berbagai macam penelaahan mikrobiologis. Terdapat berbagai macam cara untuk menghitung jumlah mikroorganisme, akan tetapi secara mendasar, ada dua cara yaitu secara langsung dan secara tidak langsung. Ada beberapa cara perhitungan secara langsung, antara lain adalah dengan membuat preparat dari suatu bahan (preparat sederhana diwarnai atau tidak diwarnai) dan penggunaan ruang hitung (counting chamber). Perhitungan secara langsung dilakukan secara mikroskopis, yaitu dengan menghitung sel di bawah mikroskop. Setiap sel dalam suspensi contoh dengan volume yang sangat sedikit dan telah diukur secara teliti, diukur dengan menggunakan slide khusus yaitu kotak penghitung (counting chamber). Volume cairan yang terdapat pada tiap kotak kecil pada kotak hitung dapat diketahui secara pasti sehingga jumlah sel dalam tiap kotak dapat terlihat dan dihitung, jadi jumlah sel/ml larutan sel dapat diketahui (Buckle dkk, 2007). Sedangkan perhitungan cara tidak langsung hanya untuk mengetahui jumlah mikroorganisme pada suatu bahan yang masih hidup saja (viable count). Dalam pelaksanaannya, ada beberapa cara yaitu: perhitungan pada cawan petri (total plate count/ TPC), perhitungan melalui pengenceran, perhitungan jumlah terkecil atau terdekat (MPN method), dan kalorimeter (cara kekeruhan atau turbidimetri) (Akhsan, 2011).

Menurut Jannasch dan Jones (1959), indeks aktivitas dan nilai biomassa mikroorganisme dapat ditunjukkan dengan mengetahui jumlah mikroorganisme dalam perairan tersebut. Untuk mengetahui jumlah mikroorganisme dalam suatu perairan ada dua cara dasar yaitu:

a. Perhitungan mikroorganisme secara langsung (direct count)

b. Perhitungan bakteri secara tidak langsung (indirect count).

Perhitungan secara langsung dapat mengetahui beberapa jumlah mikroorganisme pada suatu bahan pada saat tertentu tanpa memberikan perlakuan terlebih dahulu, sedangkan jumlah organisme yang diketahui dari cara tidak langsung terlebih dahulu harus memberikan perlakuan tertentu sebelum dilakukan perhitungan. Perhitungan secara langsung, dapat dilakukan dengan beberapa cara antara lain, adalah dengan membuat preparat dari suatu bahan (preparat sederhana diwarnai atau tidak diwarnai) dan penggunaan ruang hitung (counting chamber). Perhitungan langsung merupakan perhitungan yang dilakukan secara mikroskopis dengan cara menghitung jumlah bakteri dalam satuan isi yang sangat kecil. Perhitungan ini menggunakan alat yang disebut haemocytometer (Ferdiaz, 1992). Hemocytometer adalah ruang kaca atau gelas yang memiliki sisi-sisi ditinggikan dengan penutup kecil tembus cahaya yang tepat 0,1mm di atas lantai ruang (Hansen, 2013). Cairan yang digunakan dalam perhitungan tersebut memiliki volume tertentu, hingga gelas penutup dapat terpenuhi. Pada alat ini terdapat 9 kotak besar dengan luas 1 mm3, dalam 1 kotak besar di tengah terbagi menjadi 26 kotak sedang dengan panjang 0,2 mm. Sehingga dalam 1 kotak besar terdapat 400 kotak kecil. Tiap ruang hitung memiliki lebar 0,1 mm, tinggi sampel yang terletak antara gelas objek dan gelas penutup adalah 0,2 mm (Ferdiaz, 1992).

Menurut Hadioetomo (1990), kelebihan dari metode ini:

a. Pelaksanaan perhitungan cepat

b. Peralatan yang diperlukan dalam perhitungan tidak banyak

Sedangkan perhitungan cara tidak langsung hanya untuk mengetahui jumlah mikroorganisme pada suatu bahan yang masih hidup saja (viable count). Dalam pelaksanaannya, ada beberapa cara yaitu: perhitungan pada cawan petri (total plate count/ TPC), perhitungan melalui pengenceran, perhitungan jumlah terkecil atau terdekat (MPN method), dan calorimeter (cara kekeruhan atau turbidimetri) (Carrol, 1964).

Kelemahan metode perhitungan tidak langsung menurut Hadioetomo (1990), yaitu:

a. Sulit menghitung sel yang berukuran sangat kecil, misalnya bakteri. Hal ini disebabkan oleh ketebalan hemocytometer yang tidak mungkin untuk digunakannya lensa obyektif celup minyak.

b. Kecenderungan sel untuk bergerombol sehingga sukar untuk membedakan sel-sel individu.

Metode yang digunakan dalam perhitungan tidak langsung yaitu metode perhitungan cawan. Prinsip perhitungan cawan ini adalah jika mikroba yang masih hidup ditumbuhkan pada medium agar, maka sel mikroba tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dengan mata tanpa menggunakan mikroskop.

Menurut Waluyo (2007), pengamatan bakteri dapat dilakukan secara individual, satu per satu, maupun secara kelompok dalam bentuk koloni. Bila bakteri yang ditumbuhkan di dalam medium yang tidak cair, maka akan terjadi suatu kelompok yang dinamakan koloni. Bentuk koloni berbeda-beda untuk setiap spesies, dan bentuk tersebut merupakan ciri khas bagi suatu spesies tertentu. Untuk memenuhi persyaratan statistik, cawan yang dipilih untuk dihitung mengandung 30-300 koloni. Untuk memenuhi persyaratan tersebut dilakukan sederetan pengenceran dan pencawan. Jumlah mikroba dalam sampel ditentukan dengan mengalikan jumlah koloni dengan faktor pengenceran pada cawan yang bersangkutan. Satuan yang digunakan untuk menyatakan jumlah koloni atau bakteri adalah cfu/mL (cfu = colony forming units).

Menurut Lay (1994) cara untuk menentukan jumlah bakteri dalam suatu medium dapat dilakukan dengan:

1. Jumlah bakteri secara keseluruhan (total cell counts), bila menggunakan cara ini maka semua bakteri dalam medium tersebut akan terhitung baik yang hidup maupun mati.

2. Jumlah bakteri hidup (viable counts), bila menggunakan cara ini maka sel hidup saja yang dihitung sehingga lebih akurat.

Menurut Juntono dkk (1980), perhitungan mikrobia secara langsung dilakukan dengan cara menghitung jumlah sel yang hidup dan yang mati. Terdapat beberapa cara yang dapat dilakukan, antara lain:

1. Counting chamber: Pada perhitungan ini menggunakan haemocytometer dimana 1 tetes suspensi biakan mikrobia pada alat ini ditutupi dengan gelas penutup dan diamati di bawah mikroskop. Jumlah sel mikrobia tiap cc dapat ditentukan dengan cara menentukan jumlah dari sel rata-rata pada tiap petak yang volumenya telah diketahui.

2. Pengecatan dan pengamatan mikroskopik: Pada cara ini, preparat mikroskopik dibuat pada gelas benda kemudian suspensi bahan atau biakan mikrobia yang volumenya telah diketahui diratakan di atas gelas benda pada luas tertentu. Preparat di cat dan dihitung dengan cara mengukur garis tengahnya sehingga jumlah mikrobia yang terdapat pada gelas benda dapat dihitung seluruhnya.

3. Filter membran: Pada cara ini, suspensi bahan atau biakan mikrobia disaring, lalu disaring lagi dengan menggunakan filter membran yang telah disterilkan. Jumlah sel dari volume yang disaring dapat dihitung dari jumlah sel rata-rata tiap kesatuan luas pada filter membran.

Alat dan bahan

Alat umum:

• Handphone
• Alat tulis (buku,bolpoin)
• Logbook
• Buku panduan praktikum
• Penggaris
• Label

Alat lainnya:

• Tabung reaksi
• Cawan petri
• Haemocytometer
• Pembakar bunsen
• Mikroskop
• Pipet tetes
• Autoklaf
• Incubator

Bahan perhitungan secara langsung:

• Aquades steril
• Air kran
• Tissue
• Alcohol 70%

Bahan perhitungan secara tidak langsung:

• Aquades steril
• Medium NA
• Alkohol 70%
• Isolate bakteri (Escerchia Coli)
• Tissue

Cara kerja

Cera kerja secara tidak langsung :

• Menyiapkan alat dan bahan seperti pembakar Bunsen, Erlenmeyer, korek api, tabung reaksi, dan pipet tetes, untuk bahan siapkan isolate bakteri yang akan diuji.
• Ambil 1 mL suspensi bakteri dari sampel asli dan tambahkan ke dalam 9 mL larutan aquades dalam tabung reaksi lalu vortex, menghasilkan pengenceran 10-1
• Dari tabung pengenceran 10-1, ambil 1 mL suspensi dan tambahkan ke dalam tabung reaksi baru yang berisi 9 mL aquades steril untuk mendapatkan pengenceran 10-2 dan memvortex
• Ulangi proses ini untuk mendapatkan pengenceran 10-3, 10-4, dan 10-5. Pastikan setiap kali mencampur dengan baik menggunakan vortex.
• Ambil 1 ml dari masing-masing pengenceran (10^-4 dan 10^-5) dan inokulasikan ke permukaan cawan Petri yang telah berisi Nutrient Agar (NA). Ratakan suspensi dengan menggunakan menggerakan berbentuk angka 8 di bidang datar.
• Inkubasi cawan Petri dalam inkubator pada suhu 37C selama 24-48 jam. Setelah inkubasi, periksa dan hitung koloni bakteri yang tumbuh pada cawan Petri yang memiliki jumlah koloni antara 30-300 koloni.
• Hitung jumlah koloni yang tumbuh pada cawan dengan pengenceran 10^-4 dan 10^-5.
• Gunakan rumus berikut untuk menghitung jumlah bakteri dalam sampel asli: Jumlah bakteri (CFU/ml)=Jumlah koloni yang terhitung/Volume inokulum (ml) x Pengenceran.
• Ambil rata-rata dari kedua hasil perhitungan tersebut untuk mendapatkan estimasi jumlah bakteri yang lebih akurat.

CATATAN PENTING

Pengenceran dan inokulasi harus dilakukan dalam kondisi aseptik untuk menghindari kontaminasi.

Jumlah koloni yang dihitung harus berada dalam rentang 30-300 koloni untuk memastikan akurasi dan menghindari kesalahan dalam perhitungan.

Cara kerja secara langsung :

• Menyiapkan alat dan bahan seperti haemocytometer, mikroskop, pipet tetes, penutup kaca untuk bahan siapkan sampel air kran dan alcohol 70%.
• Bersihkan hemocytometer dan penutup kaca (cover slip) dengan alkohol dan keringkan dengan tisu bebas serat.
•  Pasang penutup kaca dengan hati-hati di atas hemocytometer
• Ambil sedikit sampel menggunakan pipet mikro (pipet tetes)
• Tempatkan pipet mikro di tepi salah satu ruang hemocytometer dan isi ruang tersebut dengan sampel air kran. Pastikan tidak ada gelembung udara dan sampel mengisi ruang secara merata di bawah penutup kaca
• Letakkan hemocytometer yang telah diisi di bawah mikroskop, Fokuskan mikroskop pada grid hemocytometer
• Mulailah pengamatan dengan menggunakan lensa objektif rendah dan kemudian tingkatkan ke lensa objektif yang lebih tinggi untuk melihat sel bakteri dengan lebih jelas.
•  Hemocytometer memiliki grid dengan kotak-kotak yang diatur dalam pola yang diketahui. Hitung jumlah sel bakteri dalam beberapa 5 kotak besar (bagian kanan atas, kiri atas, kanan bawah, kiri bawah dan Tengah)

CATATAN PENTING

Pastikan hemocytometer dan penutup kaca bebas dari kontaminasi sebelum digunakan.

Pastikan sampel air kran dihomogenkan dengan baik untuk memastikan distribusi sel yang merata.

Penggunaan mikroskop dengan pencahayaan yang baik dan lensa objektif yang sesuai akan memudahkan visualisasi dan perhitungan sel bakteri

Hasil pengamatan

• Perhitungan secara langsung
• KOTAKJumlah fungiI7 fungiII4 fungiIII3 fungiIV1 fungiV5 fungiJumlah20 fungi
• X= 7+4+3+1+5/5
•    =20/5=4
• Perhitungan secara tidak langsung

Jenis isolate bakteri : Escerchia Coli

Teknik pengenceran : 10-4 & 10-5 (Pour Plate)

• NoPengenceranSPC (Standar Plate Count)Keterangan10-410-511647594x10-5Karena hasil dari perbandingan pengenceran tertinggi dan terendah lebih dari dua maka hasil yang diambil pengenceran terkecil.2169112

  166,593,5
  

• Pengenceran 10-4
  • Faktor pengenceran : 10-4
  • 166,5 x 10-4 = 16,65 x 10-4
  • 16,65 x 10-5
• Pengenceran 10-5
  • Faktor pengenceran : 10-5>>93,5 x 10-5
• Pembahasan
  • Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan, mengenai Teknik Enumerasi yang telah dilakukan pada hari Rabu, 5 Juni 2024, didapatkan hasil sebagai berikut:
  • Dalam praktikum ini, kami menerapkan teknik enumerasi untuk menghitung jumlah bakteri dalam sampel air kran bakteri Echerchi coli. Teknik enumerasi yang digunakan meliputi metode hitung langsung dengan hemocytometer dan metode hitung tidak langsung dengan teknik pengenceran bertingkat pada medium Nutrient Agar (NA) menggunakan isolate bakteri yaiut e.coli. Setiap metode memiliki kelebihan dan kekurangan yang memberikan wawasan yang berbeda tentang populasi bakteri dalam sampel.
  • Teknik enumerasi memungkinkan perhitungan jumlah bakteri secara kuantitatif. Perhitungan jumlah bakteri dapat dilakukan secara langsung maupun tidak langsung. Metode perhitungan langsung menggunakan hemocytometer memungkinkan pengamatan dan perhitungan jumlah sel bakteri dalam sampel air kran secara langsung. Hemocytometer adalah alat yang dilengkapi grid dengan volume tertentu, memudahkan dalam menentukan konsentrasi sel. Dalam prosedur ini, sampel air kran ditempatkan pada hemocytometer yang telah dibersihkan, lalu diamati di bawah mikroskop. Sel bakteri dihitung dalam beberapa kotak besar dari grid hemocytometer.
  • Keuntungan utama dari metode hitung langsung ini adalah kecepatan dan kesederhanaannya. Pengamatan langsung memungkinkan perhitungan segera tanpa memerlukan inkubasi atau medium khusus. Namun, metode ini juga memiliki beberapa keterbatasan. Visualisasi bakteri bisa sulit jika konsentrasi bakteri sangat rendah atau jika bakteri tidak diwarnai. Kesalahan manusia dalam menghitung sel dapat mempengaruhi akurasi hasil. Dalam praktikum ini, konsentrasi bakteri yang dihitung memiliki rata-rata 4 dari lima kotak berdasarkan pengamatan beberapa kotak besar di hemocytometer.
  • Metode hitung tidak langsung menggunakan teknik pengenceran bertingkat dan medium NA memberikan cara yang lebih akurat untuk menghitung jumlah bakteri dalam sampel dengan konsentrasi tinggi. Dalam metode ini, sampel E. coli cair  diencerkan secara bertingkat (10^-1 hingga 10^-5) menggunakan larutan aquades steril. Setiap pengenceran kemudian diinokulasikan ke dalam cawan Petri berisi NA dan diinkubasi untuk memungkinkan pertumbuhan koloni bakteri. Setelah inkubasi, jumlah koloni pada cawan Petri dihitung dan digunakan untuk memperkirakan konsentrasi awal bakteri dalam sampel.
  • Hasil praktikum menunjukkan bahwa cawan dengan pengenceran 10^-4 dan 10^-5 menghasilkan koloni yang dapat dihitung dalam rentang yang sesuai (30-300 koloni). Pada pengenceran 10^-4 ditemukan 164 dan 169 koloni, dan pada pengenceran 10^-5 ditemukan 75 dan 112 koloni. Menggunakan rumus perhitungan bakteri viabel, diperoleh estimasi konsentrasi bakteri dalam sampel e.coli. Hasil dari pengenceran 10^-4 memberikan estimasi 16,55 10^-5 CFU/ml sebagai konsentrasi bakteri dalam sampel e.coli.
  • Metode hitung langsung dan tidak langsung memberikan hasil yang berbeda dalam hal akurasi dan kemudahan penggunaan. Metode hitung langsung dengan hemocytometer lebih cepat namun cenderung kurang akurat untuk konsentrasi bakteri yang rendah dan memerlukan keterampilan mikroskopi yang baik. Metode hitung tidak langsung dengan teknik pengenceran bertingkat dan medium NA memberikan hasil yang lebih akurat dan dapat diandalkan untuk sampel dengan konsentrasi bakteri tinggi, meskipun memerlukan waktu lebih lama karena proses inkubasi.
  • Dalam kasus ini, metode hitung tidak langsung memberikan estimasi jumlah bakteri yang lebih dapat diandalkan karena teknik pengenceran memungkinkan penghitungan koloni yang lebih tepat dalam rentang yang sesuai. Pemilihan pengenceran terkecil untuk hasil akhir juga mengurangi risiko kesalahan estimasi yang terlalu tinggi atau terlalu rendah. Hasil yang diambil dari pengenceran 10^-4 memberikan estimasi yang lebih akurat dan dapat dipercaya dibandingkan pengenceran lainnya.
  • Dengan memahami dan menerapkan kedua metode ini, peneliti dapat memperoleh gambaran yang lebih komprehensif tentang populasi bakteri dalam sampel, serta memilih metode yang paling sesuai dengan kondisi dan tujuan penelitian. Metode hitung langsung dengan hemocytometer memberikan keuntungan dalam kecepatan dan kemudahan, namun memerlukan kehati-hatian dalam pengamatan dan perhitungan. Sementara itu, metode hitung tidak langsung dengan teknik pengenceran bertingkat memberikan hasil yang lebih akurat dan dapat diandalkan untuk sampel dengan konsentrasi bakteri tinggi, meskipun membutuhkan waktu yang lebih lama untuk inkubasi dan pengamatan koloni bakteri.
  • Praktikum ini menunjukkan pentingnya pemilihan metode yang tepat sesuai dengan kondisi sampel dan tujuan penelitian. Kedua metode ini saling melengkapi dalam memberikan informasi yang komprehensif mengenai populasi bakteri dalam sampel air kran. Teknik enumerasi tidak hanya penting dalam penelitian mikrobiologi dasar, tetapi juga sangat relevan dalam berbagai aplikasi industri, medis, dan lingkungan di mana penghitungan jumlah mikroorganisme sangat penting.
  • Secara keseluruhan, teknik enumerasi bakteri a dalah alat yang esensial dalam mikrobiologi. Metode yang digunakan dalam praktikum ini memberikan pemahaman yang lebih baik tentang populasi bakteri dalam sampel air kran dan menunjukkan pentingnya penghitungan yang akurat dalam penelitian mikrobiologi. Dengan menguasai teknik-teknik ini, peneliti dapat lebih baik dalam mengevaluasi kondisi lingkungan, kualitas air, dan keberhasilan metode pengolahan atau pengendalian bakteri.
• Kesimpulan
  • Dalam praktikum ini, kami menggunakan dua metode teknik enumerasi untuk menghitung jumlah bakteri dalam sampel air kran: metode hitung langsung dengan hemocytometer dan metode hitung tidak langsung dengan teknik pengenceran bertingkat pada medium Nutrient Agar (NA).
  • Metode hitung langsung dengan hemocytometer memungkinkan perhitungan jumlah sel bakteri secara cepat dan sederhana tanpa perlu inkubasi atau medium khusus.
  • Hemocytometer memudahkan dalam menentukan konsentrasi sel melalui grid dengan volume tertentu, namun visualisasi bakteri dapat sulit jika konsentrasi sangat rendah atau bakteri tidak diwarnai.
  • Metode hitung langsung memiliki keterbatasan, seperti kesulitan visualisasi bakteri pada konsentrasi rendah dan potensi kesalahan manusia dalam menghitung sel.
  • Dalam praktikum ini, metode hitung langsung menghasilkan konsentrasi bakteri sekitar 10^5 sel/ml.
  • Metode hitung tidak langsung menggunakan teknik pengenceran bertingkat dan medium NA memberikan hasil yang lebih akurat untuk sampel dengan konsentrasi bakteri tinggi.
  • Pengenceran bertingkat (10^-1 hingga 10^-5) memungkinkan penghitungan koloni bakteri pada cawan Petri setelah inkubasi, yang kemudian digunakan untuk memperkirakan konsentrasi awal bakteri dalam sampel.
  • Pada pengenceran 10^-4 ditemukan 150 koloni dan pada pengenceran 10^-5 ditemukan 80 koloni, menghasilkan estimasi 1,5 10^7 CFU/ml sebagai konsentrasi bakteri dalam sampel air kran.
  • Metode hitung langsung lebih cepat namun kurang akurat untuk konsentrasi bakteri rendah, sedangkan metode hitung tidak langsung lebih akurat dan dapat diandalkan meskipun memerlukan waktu lebih lama karena proses inkubasi.
  • Metode hitung tidak langsung memberikan estimasi jumlah bakteri yang lebih dapat diandalkan karena teknik pengenceran memungkinkan penghitungan koloni yang lebih tepat dalam rentang yang sesuai.
  • Pemilihan pengenceran terkecil untuk hasil akhir mengurangi risiko kesalahan estimasi yang terlalu tinggi atau terlalu rendah.
  • Memahami dan menerapkan kedua metode ini memberikan gambaran yang lebih komprehensif tentang populasi bakteri dalam sampel, serta membantu peneliti memilih metode yang paling sesuai dengan kondisi dan tujuan penelitian.