b. Perhitungan bakteri secara tidak langsung (indirect count).
Perhitungan secara langsung dapat mengetahui beberapa jumlah mikroorganisme pada suatu bahan pada saat tertentu tanpa memberikan perlakuan terlebih dahulu, sedangkan jumlah organisme yang diketahui dari cara tidak langsung terlebih dahulu harus memberikan perlakuan tertentu sebelum dilakukan perhitungan. Perhitungan secara langsung, dapat dilakukan dengan beberapa cara antara lain, adalah dengan membuat preparat dari suatu bahan (preparat sederhana diwarnai atau tidak diwarnai) dan penggunaan ruang hitung (counting chamber). Perhitungan langsung merupakan perhitungan yang dilakukan secara mikroskopis dengan cara menghitung jumlah bakteri dalam satuan isi yang sangat kecil. Perhitungan ini menggunakan alat yang disebut haemocytometer (Ferdiaz, 1992). Hemocytometer adalah ruang kaca atau gelas yang memiliki sisi-sisi ditinggikan dengan penutup kecil tembus cahaya yang tepat 0,1mm di atas lantai ruang (Hansen, 2013). Cairan yang digunakan dalam perhitungan tersebut memiliki volume tertentu, hingga gelas penutup dapat terpenuhi. Pada alat ini terdapat 9 kotak besar dengan luas 1 mm3, dalam 1 kotak besar di tengah terbagi menjadi 26 kotak sedang dengan panjang 0,2 mm. Sehingga dalam 1 kotak besar terdapat 400 kotak kecil. Tiap ruang hitung memiliki lebar 0,1 mm, tinggi sampel yang terletak antara gelas objek dan gelas penutup adalah 0,2 mm (Ferdiaz, 1992).
Menurut Hadioetomo (1990), kelebihan dari metode ini:
a. Pelaksanaan perhitungan cepat
b. Peralatan yang diperlukan dalam perhitungan tidak banyak
Sedangkan perhitungan cara tidak langsung hanya untuk mengetahui jumlah mikroorganisme pada suatu bahan yang masih hidup saja (viable count). Dalam pelaksanaannya, ada beberapa cara yaitu: perhitungan pada cawan petri (total plate count/ TPC), perhitungan melalui pengenceran, perhitungan jumlah terkecil atau terdekat (MPN method), dan calorimeter (cara kekeruhan atau turbidimetri) (Carrol, 1964).
Kelemahan metode perhitungan tidak langsung menurut Hadioetomo (1990), yaitu:
a. Sulit menghitung sel yang berukuran sangat kecil, misalnya bakteri. Hal ini disebabkan oleh ketebalan hemocytometer yang tidak mungkin untuk digunakannya lensa obyektif celup minyak.
b. Kecenderungan sel untuk bergerombol sehingga sukar untuk membedakan sel-sel individu.
Metode yang digunakan dalam perhitungan tidak langsung yaitu metode perhitungan cawan. Prinsip perhitungan cawan ini adalah jika mikroba yang masih hidup ditumbuhkan pada medium agar, maka sel mikroba tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dengan mata tanpa menggunakan mikroskop.
Menurut Waluyo (2007), pengamatan bakteri dapat dilakukan secara individual, satu per satu, maupun secara kelompok dalam bentuk koloni. Bila bakteri yang ditumbuhkan di dalam medium yang tidak cair, maka akan terjadi suatu kelompok yang dinamakan koloni. Bentuk koloni berbeda-beda untuk setiap spesies, dan bentuk tersebut merupakan ciri khas bagi suatu spesies tertentu. Untuk memenuhi persyaratan statistik, cawan yang dipilih untuk dihitung mengandung 30-300 koloni. Untuk memenuhi persyaratan tersebut dilakukan sederetan pengenceran dan pencawan. Jumlah mikroba dalam sampel ditentukan dengan mengalikan jumlah koloni dengan faktor pengenceran pada cawan yang bersangkutan. Satuan yang digunakan untuk menyatakan jumlah koloni atau bakteri adalah cfu/mL (cfu = colony forming units).
