C. Pemekatan dan Sterilisasi Air Tebu
1. Air tebu yang telah disaring mengandung 15 % padatan terlarut, sehingga harus dipekatkan sebelum difermentasi, untuk mendapatkan kandungan etanol yang cukup sehingga mengurangi konsumsi energi selama proses pemurnian Bioetanol. Setelah dipekatkan konsentrasi sukrosa yang diharapkan adalah 22 %.
2. Agar terhindar dari kontaminasi bakteri, air tebu yang telah disaring harus disterilisasi sebelum dimasukkan ke dalam tangki fermentasi. Proses pemekatan dan sterilisasi air tebu dilakukan dengan memanaskan air tebu pada suhu 130 C atau sampai mendidih selama 30 menit. Setelah dipanaskan, air tebu kemudian didinginkan sampai suhunya sekitar 30 -- 35 C. Setelah itu siap untuk difermentasi.
D. Tahap Fermentasi
1. Tambahkan ragi sebanyak 0,2 % Â ke dalam larutan air tebu yang sudah didinginkan tersebut.
2. Aduk-aduk perlahan hingga larutan tampak sedikit berbusa.
3. Masukkan  ke dalam tangki fermentasi dan ditutup rapat.
4. Usahakan suhu tidak melebihi 36 C dan pH-nya dipertahankan 4,5-5.
Proses fermentasi akan berjalan kurang lebih 66 jam atau kira-kira 2,5 hari setelah semua bahan dimasukkan ke dalam tangki fermentasi. Kalau digunakan tangki fermentasi yang tembus pandang, misalnya dari kaca, maka akan tampak gelembung-gelembung udara kecil-kecil dari dalam fermentor. Gelembung udara ini adalah gas CO2 yang dihasilkan selama proses fermentasi. Tanda proses fermentasi sudah selesai, tidak terlihat lagi gelembung CO2 ini. Kadar etanol di dalam cairan fermentasi kurang lebih 7% -10%.
E. Tahap Destilasi