Membran luar
Membran luar, membran yang melapisi keseluruhan organel terdiri dari protein dan lipid dengan perbandingan yang sama. Membran luar mengandung protein porin yang menyebabkan membran ini bersifat permeabel terhadap molekul-molekul kecil yang berukuran 5000 Dalton. Dalam hal ini, membran luar mitokondria menyerupai membran luar bakteri gram-negatif. Selain itu, membran luar juga mengandung enzim yang terlibat dalam bermacam-macam aktivitas sel, seperti biosintesis asam lemak, oksidasi atas epinefrin, dan degradasi atas tryptophan.
Apabila membran luar rusak, dapat berakibat protein di ruang antara membran luar dan membran dalam untuk menyusup ke sitosol, berakibat pada kematian sel.
Ruang antar membran dalam dan membran luar (Ruang intermembran)
Ruang intermembran adalah ruang yang berada di antara membran dalam dan membran luar yang juga dikenal sebagai ruang perimitochondrial. Karena membran luar bersifat bebas permeable untuk molekul kecil, maka konsentrasi molekul kecil (seperti ion dan gula) di ruang intermembran sama seperti sitosol. Untuk protein berukuran besar, harus bersifat spesifik dan tertentu untuk dapat diangkut melalui membran luar. Maka komposisi protein di ruang ini berbeda dengan komposisi protein di sitosol. Satu protein yang dilokalisasi ke ruang intermembran menjadi sitokrom c.
Membran dalam
Membran dalam kurang permeabel dibandingkan membran luar terdiri dari 20% lipid dan 80% protein. Membran ini merupakan tempat utama pembentukan ATP. Pada membran dalam, terdapat lekuk-lekuk yang disebut krista. Membran dalam juga membentuk dua ruangan internal mitokondria, yaitu ruangan sempit intermembran serta ruangan matriks yang berisi enzim respirasi sel, ribosom, DNA, dan RNA.
Krista
Membran dalam mitokondria tersusun atas banyak krista, yang dapat memperluas permukaan membran dalam, sehingga dapat meningkatkan produktivitas respirasi sel dan produksi ATP. Pada mitokondria hati, daerah membran dalam sekitar lima kali lebih luas daripada membran luar. Luas membran dalam pada mitokondria tergantung pada besarnya permintaan untuk ATP. Misalnya sel otot, mengandung lebih banyak krista. Lipatan krista pada sel otot memiliki benjolan-benjolan yang kecil bulat, disebut sebagai partikel F1 atau oksisom.
Matriks
Matriks adalah ruang yang tertutupi oleh membran dalam. Matriks terdiri atas 2/3 dari total protein mitokondria. Matriks sangat penting dalam hal produksi ATP dengan bantuan sintesis ATP yang di dalam membran dalam. Matriks tersusun atas konsentrasi campuran dari ratusan enzim, ribosom mitokondrial special, tRNA, dan beberapa salinan dari genom DNA mitokondria (mtDNA). Dari enzim, fungsi utamanya termasuk oksidasi atas pyruvate dan asam lemak, serta siklus asam sitrat. Matriks adalah rumah bagi mtDNA (DNA mitokondria)
