Jika kita tidak ikhas menerima kehilangan, maka hal tersebut akan terus menghantui sampai kapanpun. Bisa jadi hal itu akan menghantui sepanjang hidup kita.
Film Nini Thowok diadaptasi dari cerita urban legend dengan nuansa mistis dari masyarakat Jawa Tengah (Klaten, Solo, dan Yogyakarta) yang sudah lama terlupakan. Awalnya, penulis menyangka bahwa film ini akan bercerita tentang kehidupan biografi dari seorang seniman yang bernama Didik Hadiprayitno atau yang lebih dikenal sebagai penari dengan nama panggung, Didik Ninik Thowok. Ternyata, persepsi itu salah.
Nini Thowok merupakan boneka berpakaian yang terbuat dari batok kelapa dan menyerupai jelangkung perempuan. Boneka ini berfungsi sebagai sarana memanggil arwah atau roh. Ukurannya hampir menyerupai manusia. Boneka Nini Thowok juga masih menjadi koleksi Museum Kesehatan dr. Adyatma atau Museum Santet di kota Surabaya, Jawa Timur.
Bukan bercerita tentang boneka Nini Thowok yang ada di museum tersebut, Film Nini Thowok justru bercerita tentang gadis yatim piatu bernama Nadine (Natasha Wilona) dan adik perempuannya, Naya (Nicole Rossi) yang terpaksa pindah dari Jakarta ke Solo untuk mengelola losmen Mekar Jiwo setelah eyang Marni (Jajang C. Noer) meninggal. Di losmen ada satu kamar terlarang yang tidak boleh dibuka oleh Mbok Ghirah (Ingrid Widjanarko) dan Pak Rahmat (Slamet Ambari).
Nadine penasaran dan nekat membuka kamar yang menyimpan benda-benda peninggalan pemilik losmen di masa lalu dengan sejarah berdarah. Setelah kamar berhasil terbuka, berbagai kejadian mistis mulai menghantui Nadine hingga akhir cerita.
Di dalam kamar terdapat boneka Nini Thowok yang konon sering digunakan untuk berkomunikasi dengan roh halus. Nadine mulai cari tahu, siapa pemilik boneka tersebut sekaligus pemilik pertama losmen yang ditempatinya.
Setelah mendengar cerita dari Mbok Ghirah, losmen diketahui merupakan peninggalan keluarga keturunan Cina bernama Nyonya Oei (Gesata Stella) yang meninggal secara mengenaskan. Perempuan yang ada di dalam lukisan tersebut menjadi pemilik losmen dan mati penasaran karena mencari anak perempuan yang hilang.
Teror mistis terus berlangsung, membuat Nadine berusaha mencari tahu apa yang telah terjadi di losmen sejak puluhan tahun silam. Ada urusan yang belum terselesaikan karena jasad anak perempuan Nyonya Oey masih disembunyikan oleh Pak Rahmat.
Lantas, apa hubungan antara boneka Nini Thowok dengan Nyonya Oei? Akankah Nadine mampu membongkar rahasia dari balik boneka Nini Thowok yang juga menyeret kisah masa kecil Pak Rahmat?
