cm
5 cm
Kuning
0,76
cm
Â
- PembahasanÂ
   Untuk membuat campuran eluen n-butanol, asam asetat glasial, dan aquades, corong pisah digunakan untuk mencampur ketiga larutan tersebut dan dikocok sehingga terbentuk campuran yang berwarna keruh. Setelah didiamkan, campuran tersebut terbentuk menjadi dua lapisan. Caquades berwama keruh menutupi lapisan atas, dan caquadesan hening tak berwama menutupi lapisan bawah. Dua lapisan ini terbentuk karena ketiga larutan tidak dapat bercampur secara sempurna. Ini terjadi karena aquades dan asam asetat, yang keduanya adalah senyawa kovalen polar, dapat bercampur secara sempurna, serta n-butanol dan asam asetat, yang keduanya merupakan senyawa organik. Sementara aquades dan n-butanol hanya dicampur sebagian, ada dua lapisan pada campuran ketika didiamkan setelah dikocok. Dalam proses pembuatan eluen ini, penambahan asam asetat dilakukan dengan tujuan untuk untuk mendistribusikan kedua pelarut yang tidak saling bercampur. Larutan n-butanol dan aquades dapat terdistribusi dalam asam asetat sehingga dengan penambahan asam asetat glasial pada perbandingan volume tertentu dapat diperoleh campuran atau larutan yang mengandung n-butanol, asam asetat dan aquades.
   Tujuan dari pengocokan adalah untuk meningkatkan distribusi antara ketiga caquadesan tersebut. Dalam hal ini, pelarut nonpolar n-butanol bertindak sebagai fase gerak, dan pelarut polar aquades (air) bertindak sebagai fase diam. Ada perbedaan distribusi asam amino yang membentuk campuran asam amino dalam fase gerak dan aquades sebagai fase diam. Akibatnya, fase diam yang teradsorpsi dilewati oleh komponen non polar dari eluen, seperti n-butanol atau fenol non polar.
    Kertas kromatografi yang digunakan harus steril. dilindungi dari kontak langsung dengan tangan, jadi gunakan penjepit atau slop tangan untuk melengkapi tangan. Sangat mungkin untuk mengganggu proses kromatografi jika tangan terhubung langsung ke kertas kromatografi. Tangan sering lembab karena tubuh mengeluarkan keringat. Karena minyak dan urea, zat organik yang terkandung dalam keringat ini, senyawa-senyawa organik tersebut mungkin ikut bemigrasi dalam fase nonpolar, atau fase gerak. Hal inilah yang dapat mempengaruhi proses dan hasil kromatografi pada akhirnya. Pertama, wadah kromatografi harus dijenuhkan dengan eluen. Ini dilakukan dengan memasukkan eluen fenol ke dalam wadah dan menutupnya. Tujuan penjenuhan adalah untuk memungkinkan kondisi ugur kromatografi berkembang lebih cepat. Ini disebabkan oleh fakta bahwa ketika udara dalam kromatografi menjadi jenuh seperti kertasnya, ketika elusi sampel dimulai, fokus akan mengelusi bagian sampel.
    Karena penotolan asam amino dan sampel pada kertas kromatografi harus memiliki diameter tidak melebihi 0,4 cm, ada kemungkinan bahwa fase gerak dan fase diamnya akan terembes. Akibatnya, warna yang terdeteksi menjadi terlalu tersebar dan mengganggu hasil pengamatan, sehingga sulit untuk menghitung harga Rf. Kertas kromatografi yang digunakan berisi larutan asam amino yang terdiri dari triptofan, leusin, tirosin, glisin, sampel A, sampel B, dan sampel C. Kemudian, kertas kromatografi yang sudah berisi larutan dimasukkan ke dalam wadah kromatografi yang telah dipenuhi dengan eluen fenol. Diusahakan agar pencelupan tidak merendam totolan asam amino, sampel, atau garis tepi yang sudah diukur. Eluen langsung merembes melalui totolan larutan yang diuji setelah kertas kromatografi dicelupkan. Rembesan cuplikan akan membawa komponen larutan yang diuji ke dalam eluen. Karena kelarutan masing-masing komponen dalam eluen berbeda, kecepatan bergerak dalam kertas juga berbeda. Setelah eluen bergerak sekitar sepuluh milimeter, pembebasan dihentikan.
   Pada langkah di mana noda diidentifikasi atau dilihat, jarak tempuh eluen ditandai dengan pensil dan kertas dikeringkan di dalam oven pada suhu 100--105 derajat Celcius. Suhu ini disebabkan oleh fakta bahwa molekul aquades akan menguap pada suhu ini. Setelah kering, larutan ninhidrin disemprotkan pada kertas kromatografi untuk memudahkan pengamatan karena ninhidrin akan menghasilkan wama saat bereaksi dengan asam amino. Namun, karena diduga masih ada molekul aquades yang teradsorpsi, semprotan ninhidrin menimbulkan warna secara tidak langsung. Ini karena ninhidrin tidak dapat bereaksi sepenuhnya dengan asam amino yang terdistribusi pada kertas kromatografi. Untuk melakukannya, kertas dikeringkan kembali di dalam oven listrik. Setelah kering, bercak-bercak ungu atau merah muda muncul, yang menunjukkan adanya asam.
