Penggunaan Kromatografi Kertas dalam Praktikum Pemisahan Asam Amino dari Sampel Unknown

Kromatografi merupakan suatu metode yang didasarkan atas distribusi diferensial komponen sampel diantara dua fase yaitu fase diam dan fase gerak.  Padatan atau cairan yang terikat pada permukaan padatan (kertas atau suatu absorben) dapat disebut sebagai fase diam. Sedangkan cairan disebut eluen atau pelarut, atau gas pembawa yang inert dapat disebut sebagai fase gerak. Gerakan fasa gerak ini mengakibatkan terjadinya migrasi diferensial komponen-komponen dalam sampel (Tika, 2010). 

Berdasarkan sifat nya, metode analisis dapat dibagi menjadi dua jenis, yaitu konvensional dan modern. Kromatografi modern meruapakn teknik pemisahan komponen aktif dari suatu senyawa dengan berat molekul yang tinggi menggunakan instrument canggih, seperti HPLC (High Performance Liquid Cromatography) dan GC-MS (Gas Cromatography-Mass Spectrophotometry). Sedangkan kromatografi konvensional merupakan teknik pemisahan yang dilakukan menggunakan isntrumen sederhana, seperti kromatografi kertas,kromatografi kolom, dan kromatografi lapis tipis. (Buku Informasi, 2018).

Metode kromatografi kertas merupakan suatu teknik pemisahan sederhana atau konvensional yang digunakan untuk memisahkan komponen pigmen (Mubarok, 2021). Kromatografi kertas dapat dikatakan sebagai bidang khusus kromatografi cair -- cair. Fasa diam berupa lapis tipis cairan yang terserap oleh kertas. Pengerjaannya sangat sederhana. Penempatan satu tetes cuplikan pada ujung kertas dan kemudian mencelupkannya ke dalam pelarut (eluen) sudah cukup untuk memisahkan komponen-komponen cuplikan (Tika, 2010). 

Dalam kromatografi kertas komponen yang dipisahkan harus larut dalam fase gerak dan harus memiliki kemampuan untuk berinteraksi dengan fase diam dengan cara melarut di dalamnya, teradsorpsi, atau berinteraksi secara kimia (penukar ion). Pemisahan terjadi didasarkan atas perbedaan migrasi zat-zat yang menyusun suatu sampel (Soebagio,dkk., 2003). Pada kromatografi kertas, zat ditempatkan dengan pipa kapiler pada kertas, kemudian campuran pelarut (eluen) bermigrasi melewati noda (spot) dengan arah ke atas (ascending) atau ke bawah (descending). Kestabilan kertas, pelarut yang dipilih, dan temperature sangat dapat mempengaruhi cepat lambatnya proses migrasi (Christina, 2019)

Setiap benda ataupun makhluk hidup di dunia mengandung banyak senyawa-senyawa kimia di dalamnya. Baik itu senyawa organic maupun anorganik. Salah satu senyawa organic yang terkandung dalam makhluk hidup adalah asam amino. Christina (2019) meyebutkan asam amino merupakan molekul organik dengan massa molekul rendah (antara 100-200Da) yang mengandung setidak-tidaknya yaitu satu gugus karboksil (-COOH) dan satu gugus amino (-NH2). 

Asam amino sangat berperan penting dalam kehidupan manusia, seperti memastikan pembelahan sel terjadi dengan sempurna, dalam tubuh berjalan lancar metabolisme, memelihara daya ingat, pertumbuhan, penyembuhan hingga sebagai bangunan blok protein yang linear dari rantai asam amino. Asam amino yang terkandung dalam makhluk hidup (yang selanjutnya disebut sampel) dapat dipisahkan menggunakan metode kromatografi kertas.

Dalam percobaan ini dilakukan analisis secara kualitatif terhadap larutan yang mengandung bermacam-macam asam amino. Pengamatan yang dilakukan cukup sulit mengingat asam amino yang terlarut tidak menunjukkan warna tertentu. Untuk mengantisipasi hal tersebut, maka setelah elusi dihentikan, posisi eluen ditandai dengan pensil, lalu kromatogram dikeringkan dan selanjutnya disemprot dengan larutan ninhidrin. 

Ketika asam amino bereaksi dengan ninhidrin terjadi pelepasan CO2 dan NH3 sehingga asam amino dapat ditentukan secara kuantitatif dengan mengukur jumlah CO2 atau NH3 yang dilepaskan. Prolin dan hidroksi prolin menghasilkan kompleks yang berbeda warnanya dengan asam amino lainnya. Kompleks berwarna yang terbentuk mengandung dua molekul ninhidrin yang bereaksi dengan amonia yang dilepaskan pada oksidasi asam amino. Keseluruhan reaksi asam amino dengan ninhidrin adalah sebagai berikut: (1) dekarboksilasi oksidatif dari asam amino dan produksi ninhidrin tereduksi, amonia, dan karbon dioksida (2) reaksi ninhidrin tereduksi dengan molekul ninhidrin yang lain dan dengan molekul amonia yang dibebaskan dan (3) pembentukan kompleks berwarna biru (Tika, 2010).

Setiap komponen memiliki harga Rf tertentu. Jarak yang ditempuh oleh setiap senyawa dari garis dasar relatif terhadap jarak tempuh pelarut/eluen didefinisikan sebagai Rf (retordation factor).

Nilai Rf dari suatu senyawa pada sistem kromatografi kertas bergantung pada banyak faktor, seperti  pelarut, temperatur, sifat dari campuran, dan jenis kertas yang digunakan.

Mubarok (2021) menjelaskan faktor-faktor yang mempengaruhi nilai Rf, yaitu sebagai berikut.

• Pelarut
• Pelarut dapat mempengaruhi nilai Rf karena dapat mengubah koefisien partisi. Adanya perubahan-perubahan kecil dalam komposisi pelarut dapat menyebabkan perubahan pada nilai Rf.
• Temperatur
• Temperatur dapat mempengaruhi nilai Rf karena perubahan temperature dapat mempengaruhi perubahan koefisien partisi dan kecepatan aliran.
• Sifat dari campuran
• Berbagai senyawa mengalami partisi di antara volume yang sama dari fase diam dan fase gerak, sehingga dapat mempengaruhi karakteristik kelarutan zat satu terhadap zat lainnya hingga nilai Rf.
• Jenis kertas
• Kertas yang digunakan dapat memperngaruhi nilai Rf karena adanya perbedaan ion dan serapan pada kertas-kertas yang umum digunakan dalam kromatografi kertas. Selain itu, jenis kertas mempengaruhi kecepatan aliran dan keseimbangan partisi dalam kromatografi kertas.

. Oleh karena pengaruh faktor-faktor tersebut, nilai Rf suatu senyawa yang sudah diketahui dijadikan standar atau patokan untuk menentukan Rf senyawa lainnya. Untuk analisa kualitatif, senyawa tertentu yang sudah diketahui digunakan bersama-sama dengan senyawa yang akan diidentifikasi. Dua senyawa yang berbeda dalam satu sistem pelarut tertentu dapat memiliki nilai Rf yang sama. Oleh karena itu, hasil analisa yang diperoleh dengan teknik kromatografi kertas, harus dijustifikasi dengan metode lain. Untuk mengukur nilai Rf memerlukan melokalisir permukaan pelarut. Nilai Rf biasanya dinyatakan dalam bentuk fraksi/bagian. Perbedaan nilai Rf untuk dua senyawa yang dipisahkan bergantung pada besar noda-noda dan panjang aliran zat terlarut.

Senyawa yang dianalisa dengan teknik kromatografi kertas dapat ditentukan lokasinya pada kertas dengan berbagai cara. Bila senyawa yang diuji menyerap sinar UV atau berfluoresensi dengan sinar UV, noda atau spot dapat dideteksi dengan penyinaran menggunakan sinar UV di tempat yang gelap (Redhana, 2010).

Alat dan Bahan

Dalam percobaan pemisahan asam amino dari sampel unknown menggunakan kromatografi kertas, alat yang digunakan adalah pipet kapiler, ruang kromatografi, spatula, corong pisah, penggaris, gunting, heater, penyemprot, gelas kimia (250 mL, 100 mL) dan pipet tetes. Bahan-bahan yang diperlukan dalam percobaan ini adalah aquades, larutan n-butanol, asam asetat glasial, kertas kromatografi, fenol, larutan ninhidrin, larutan triptofan, larutan leusin, larutan tirosin, larutan metionin, larutan glisin, larutan sampel A, larutan sampel B, dan larutan sampel C.

Prosedur Kerja

• Pembuatan Larutan Elusi
• 100 mL larutan n-butanol ditambahkan dengan 100 mL aquades dan 24 mL asam asetat
• Ketiga larutan tersebut ditempatkan dalam corong pisah dan dikocok.
• Kedua lapisan yang terbentuk kemudian dipisahkan.
• Sebanyak 100 mL larutan fenol disaring dari larutannya sehingga didapatkan larutan bening yang bersih dari pengotor.
• Penyiapan Kertas Kromatografi
• Kertas kromatografi disiapkan dengan ukuran yang disesuaikan dengan wadah kromatografi
• Pada bagian sekitar 1,5 cm dari tepi bawah kertas ditandai dengan pensil
• Proses Kromatografi dengan Menggunakan Eluen Campuran n-Butanol, Aquades, dan Asam Asetat Glasial
• Kertas kromatografi 15 x 25 cm ditandai dengan menggunakan pensil 1,5 cm dari tepi bawah.
• Larutan standar asam amino dan sampel ditotolkan berdampingan dengan jarak 1,5 cm. larutan ujung terletak 2 cm dari pinggir kertas, lalu dikeringkan
• Kertas kromatografi digantungkan dalam ruang kromatografi.
• Elusi dihentikan ketika eluen menempuh jarak 10 cm dan ditandai dengan pensil.
• Kertas dikeringkan pada suhu 105-1100C.
• kertas disemprot dengan larutan ninhidrin dan dikeringkan kembali.
• Jarak noda--noda diukur dan dihitung harga Rf-nya.
• Proses Kromatografi dengan Menggunakan Eluen Fenol
• Kertas kromatografi dengan ukuran 15 x 25 cm ditotolkan dengan larutan uji menggunakan pipa kapiler dengan jarak totolan 1,5 cm dengan besar noda lebih kecil atau sama dengan 0,4 cm.
• Kertas kromatografi yang telah ditotolkan sampel kemudian digantung dalam ruang kromatografi selama beberapa jam agar elusi berjalan.
• Setelah larutan elusi berjalan kurang lebih 10 cm dari batas sampel, elusi dihentikan dan kertas kromatografi dikeluarkan.
• Batas larutan ditandai dengan menggunakan pensil dan kertas kromatografi dikeringkan pada suhu 100--1050C.
• Kertas yang telah dikeringkan disemprot dengan larutan ninhidrin dan dikeringkan.
• Jarak eluen dengan jarak warna yang terbentuk diukur.

Refrensi:

Purba, Michael. 2004. Kimia Untuk SMA Kelas XII. Jakarta: Erlangga

Redhana, I Wayan. 2010. Penuntun Praktikum Biokimia. Singaraja : Universitas Pendidikan Ganesha

Soebagio, dkk. 2003. Kimia Analitik II. Malang: IMSTEP

Tika, I Nyoman. 2010. Penuntun Praktikum Biokimia. Singaraja: Universitas Pendidikan Ganesha.

Buku Informasi Melaksanakan Analisa Secara Kromatografi Konvensional Mengikuti Prosedur. 2018.  Jakarta: Pusat Pengembangan dan Pemberdayaan Pendidik dan Tenaga Kependidikan Pertnian.

Mubarok, F. (Juni 2021). Kromatografi Kertas Prinsip dan Cara Kerja. https://www.researchgate.net/publication/352291935_Kromatografi_Kertas_Prinsip_dan_Cara_Kerja  (diakses pada 06 Juli 2022)

Pramesti, I. A. P. D. P., dan Dara, M. C. D. 2018. Laporan Praktikum Biokimia Percobaan V: Kromatografi Kertas Asam Amino. Singaraja:Undiksha

Christina, N. P. Y. 2019. Identifikasi Kandungan Asam Amino pada Sampel Unknown Menggunakan Teknik Kromatografi Kertas. Singaraja: Undiksha