EColi: Dari Bakteri Usus Menjadi Penghasil Insulin

Proses pelarutan dilakukan dengan menggunakan agen denaturasi kuat seperti urea atau guanidin hidroklorida untuk mengurai agregat protein dan membuatnya menjadi larut. Langkah ini diikuti oleh proses renaturasi yang sangat krusial, di mana protein harus dilipat kembali dengan benar ke dalam struktur tiga dimensi aktifnya. Tahap renaturasi ini membutuhkan pengaturan kondisi yang sangat tepat, termasuk pengontrolan pH, suhu, serta konsentrasi ion, untuk menghindari pembentukan kembali agregat protein yang akan merusak fungsinya. Jika kondisi ini tidak dijaga, protein akan cenderung menggumpal kembali dan kehilangan aktivitas biologisnya, sehingga gagal memenuhi fungsi terapeutiknya (Wang et al. 2013; Zielinski et al. 2019). 

Setelah tahap renaturasi berhasil, protein terlarut ini kemudian melalui tahap pemurnian awal dengan menggunakan kromatografi DEAE Sepharose, sebuah metode kromatografi penukar anion yang memisahkan protein berdasarkan muatan permukaannya. Pada tahap ini, insulin prekursor dipisahkan dari kontaminan lain yang memiliki muatan berbeda (Strickland et al. 2008).  

Selanjutnya, pro-insulin diolah melalui reaksi enzimatik dengan tripsin, yang bertugas memotong segmen tertentu dari protein untuk membentuk struktur yang lebih dekat dengan insulin. Proses ini diikuti dengan sitronilasi, yakni penambahan gugus sitronil untuk memodifikasi gugus amino yang dibutuhkan dalam pembentukan insulin yang lebih stabil secara kimiawi. Langkah berikutnya adalah melarutkan insulin dalam bentuk garam seng. Proses ini berfungsi untuk meningkatkan stabilitas protein sekaligus mempermudah proses pengendapan. Insulin kemudian diendapkan dengan menyesuaikan kondisi tertentu seperti pH atau konsentrasi ion, yang memisahkan insulin dari kontaminan terlarut lainnya, menghasilkan produk yang lebih murni (De Mey et al. 2007; Zielinski et al. 2019). Untuk menghilangkan pengotor tambahan, protein ini kemudian diproses menggunakan kromatografi Q Sepharose, yang merupakan teknik pemurnian lebih lanjut. Setelah itu, insulin mentah ini diolah kembali melalui reaksi enzimatik dengan karboksipeptidase B. Enzim ini menghilangkan residu asam amino terminal sehingga struktur akhir insulin menjadi sangat mirip dengan insulin manusia asli (Heinemann et al. 1995). Proses pemurnian dilanjutkan dengan kromatografi Sephadex G-25, yang memisahkan pengotor kecil berberat molekul rendah, dan tahap akhir menggunakan High-Performance Liquid Chromatography (HPLC). HPLC adalah metode kromatografi berpresisi tinggi yang memungkinkan pemisahan protein berdasarkan ukuran dan polaritasnya, menghasilkan produk insulin dengan kemurnian yang sangat tinggi (Liu et al. 2015).

Dengan kombinasi dari tahapan-tahapan pemurnian ini, insulin rekombinan yang dihasilkan memenuhi standar kualitas farmasi dan siap digunakan sebagai terapi bagi penderita diabetes. Proses ini menjamin bahwa insulin yang dihasilkan tidak hanya aktif secara biologis tetapi juga stabil dan aman untuk penggunaan klinis.

Pemanfaatan Teknik Rekombinan Untuk Pembuatan Insulin

Gambar 3  Vector plasmid pIBAINS yang disisipkan dengan insulin manusia pada rantai B (Zielinski et al. 2019).

Untuk membuat insulin manusia, dibutuhkan teknik rekombinan yang dapat memproduksi insulin manusia dengan jumlah yang banyak, cepat, dan dengan harga yang terjangkau. Untuk rekombinan ini, dibutuhkan host kultur berupa Escherichia coli 20 strain IBA 1. Bakteri ini merupakan turunan dari Escherichia coli K-12 yang akan digunakan dalam proses transformasi. Jenis isolat ini digunakan sebagai host karena telah mengalami modifikasi, yaitu telah dihilangkan bagian proline-lactose operonnya. Hal ini bertujuan untuk meningkatkan efisiensi dalam menghemat energi bagi host serta mengurangi interfensi gen-gen lain dari operon sehingga ekspresi insulin yang diinginkan bisa lebih stabil. Kemudian, telah dimutasi juga bagian dari gen rpsL yang mengkoding resistensi streptomycin atau ribosomal protein S12. Hal ini bertujuan agar nantinya saat ditransformasi dengan vector plasmid, sel yang tidak mengandung plasmid tidak akan hidup karena tidak resisten terhadap streptomycin. Selain itu, dengan adanya resistensi streptomycin, akan memungkinkan sel host untuk "membutuhkan plasmid" sehingga tidak akan dibuang oleh dirinya. Selanjutnya, host ini juga telah dimodifikasi dengan cara bagian gen cytR yang berfungsi dalam regulator transkripsionalnya sudah dimutasi sehingga lebih baik dalam memproduksi human insulin karena dapat meningkatkan ekspresi gen. Kemudian, digunakan vektor plasmid juga berupa pIBAINS yang merupakan turunan dari plasmid pBR322 (Zielinski et al. 2019). 

Kelebihan dan Kelemahan Insulin Manusia Buatan

Dahulu manusia memanen insulin dari pankreas babi dan sapi. Akan tetapi, proses untuk mengembangbiakan dan memelihara hewan memakan biaya yang besar dan membutuhkan waktu yang lama. Dengan mengandalkan mikroorganisme seperti E. coli produksi insulin dapat diproduksi dengan cepat. Tidak seperti hewan ternak, E. coli tidak membutuhkan lahan luas, pakan, hingga perawatan yanf relatif lebih mudah. Selain itu insulin rekombinan E. coli juga mampu mereplikasi 100% insulin manusia, insulin hewan ternak dapat menimbulkan alergi bagi beberapa individu (Allen et al. 2019; Baeshen et al. 2014; Fuquay et al. 2011).  Akan tetapi, terkadang produksi insulin berbasis mikroorganisme seperti E. coli juga memiliki kekurangan. Kekurangan paling terlihat dari pemakaian E. coli untuk produksi insulin adalah adanya kemungkinan produksi insulin yang sedikit dan bahkan tidak ada sama sekali. Untuk menanggulangi hal tersebut perlu diperhatikan beberapa hal. Konsentrasi inducer atau senyawa yang dapat menginduksi produksinya insulin tersebut. Selain itu, proses pemurnian insulin dari E. coli juga cukup rumit sehingga biaya produksi dan waktu produksi dapat membengkak (Jayakrishnan et al. 2024). 

Contoh Insulin Komersial

Pada tahun 1982, FDA melegalkan penjualan dan penggunaan insulin yang diproduksi dalam E. coli. Saat ini sudah tersedia berbagai produk insulin berbasis E. coli yang dapat dijumpai (Riggs 2020). Salah satu contoh insulin yang sudah diproduksi massal adalah berlinsulin oleh Bernie-Chernie. Beberapa tipe insulin lain seperti insulin lispro, insulin glargine, hingga insulin glulisine  juga sudah diproduksi secara massal. Onset kerja dari insulin-insulin ini juga variatif tergantung pada formulasi pembuatanya (Siew & Zhang 2021).