Kromatografi Kertas

                             Dorkas Lase

Jurusan Kimia, Universitas Pendidikan Ganesha

          Jalan Udayana, No. 11 Singaraja, Bali

           Email: dorkaslase409@gmail.com 

                                   Abstract

Praktikum ini bertujuan untuk mengidentifikasi asam amino yang terkandung dalam sampel unknown melalui kromatografi kertas dengan teknik ascending. Metode yang digunakan merupakan metode kualitatif dengan prinsip kerja kromatografi kertas. Hasil percobaan menunjukkan harga Rf sampel dengan eluen campuran n-butanol dan asam asetat glasial dan eluen fenol adalah sebagai berikut; Rf sampel unknown A adalah 0,34 dan 1; Rf sampel unknown B adalah 0,72 dan 0,82; Rf sampel unknown C adalah 0,83 dan 0,88; Rf sampel unknown D adalah 0,26 dan 0,59; dan Rf sampel unknown E adalah 0,8 dan 0,79. Jadi dapat disimpulkan bahwa (1) sampel unknown A mengandung sistein dan valin; (2) sampel unknown B mengandung leusin; (3) sampel unknown C mengandung tirosin; (4) sampel unknown D mengandung glisin dan arginin; (5) sampel unknown E mengandung fenilalanin dan arginin. 

Kata kunci: eluen, Rf, kromatografi kertas. 

PENDAHULUAN 

Kromatografi adalah salah satu metode pemisahan kimia yang didasarkan pada adanya perbedaan partisi zat pada fasa diam (stationary phase) dan fasa gerak (mobile phase). Fase gerak membawa zat terlarut melalui media sehingga terpisah dari zat terlarut lainnya yang terelusi lebih awal atau lebih akhir. Fase diam dapat bertindak sebagai penyerap, seperti alumina dan slika gel atau dapat bertindak melarutkan zat terlarut sehingga terjadi partisi antara fase diam dan fase gerak. Dalam proses ini suatu lapisan cairan pada penyangga yang inert berfungsi sebagai fase diam. 

Dalam kromatografi selalu terdapat salah satu kecenderungan sebagai berikut; (a) kecenderungan molekul-molekul komponen untuk melarut dalam cairan; (b) kecenderungan molekul-molekul komponen untuk melekat pada permukaan padatan halus; (c) kecenderungan molekul-molekul komponen untuk bereaksi secara kimia (penukar ion); (d) kecenderungan molekul-molekul tereklusi pada pori-pori fasa diam. Pemisahan terjadi berdasarkan perbedaan migrasi zat -- zat yang menyusun suatu sampel. Hasil pemisahan dapat digunakan untuk keperluan identifikasi untuk analisis kualitatif, penetapan kadar untuk analisis kuantitatif, pemurnian suatu senyawa (Soebagio,dkk. dalam Tika, 2010). 

Terdapat berbagai macam jenis kromatografi berdasarkan wujud fase gerak dan fase diamnya. Salah satu contonya adalah kromatografi kertas yang terdisi dari fase diam dan fase gerak berupa cairan. Adsorben dalam kromatografi kertas adalah kertas saring, yakni selulosa. Sampel yang akan dianalisis ditotolkan ke ujung kertas yang kemudian digantung dalam wadah. Kemudian dasar kertas saring dicelupkan kedalam pelarut (fase gerak) yang dapat berupa air, etanol, atau asam asetat. Kromatografi kertas dapat digunakan untuk mengidentifikasi asam amino yang terdapat dalam suatu sampel. Hal ini pertama kali dilakukan oleh seorang kimiawan Inggris Richard Laurence Millington Synge (1914- 1994). 

Senyawa kompleks yang tersusun atas asam amino dapat disederhanakan dengan menggunakan metode kromatografi kertas. Saat campuran asam amino menaiki lembaran kertas secara vertikal karena ada fenomena kapiler, partisi asam amino antara fasa mobil dan fasa diam (air) yang teradsorbsi pada selulosa berlangsung berulang-ulang. 

Ketiak pelarut mencapai ujung atas kertas proses dihentikan. Setiap asam amino bergerak dari titik awal sepanjang jarak tertentu. Dari nilai Rf, masing-masing asam amino dapat diidentifikasi. Setiap komponen memiliki harga Rf tertentu. Besaran Rf ini merupakan derajat retensi suatu komponen dalam fasa diam. Karena itu, Rf juga disebut dengan factor retensi. Harga Rf dapat dihitung dengan dengan jarak yang ditempuh oleh komponen dibagi dengan arak tempuh eluen (Tika, 2010). 

METODE 

Percobaan (praktikum) ini dilaksanakan dilaboratorium kimia organik jurusan kimia program studi pendidikan kimia Universitas Pendidikan Ganesha pada tanggal 29 Februari 2024 , pukul 13.30-18.30 Wita.  Alat yang digunakan dalam percobaan tersebut adalah pipa kapiler; ruang kromatografi; gelas kimia 250 mL; gelas kimia 100 mL; batang pengaduk; spatula; penggaris; gunting; penjepit kayu; pemanas listrik; dan pipet tetes. Bahan-bahan yang digunakan dalam percobaan adalah larutan elusi n-butanol, asam cuka dan air; kertas kromatografi; etanol 95%; HCl pekat; Fenol; larutan ninhidrin; larutan sistein; larutan penilalanin; larutan leusin; larutan glisin; larutan arginin; larutan valin; larutan triptofan; larutan tirosin; larutan unknown A; larutan unknown B; larutan unknown C; larutan unknown D; dan larutan unknown D.  Langkah kerja praktikum diawali dengan menyiapkan dan membersihkan alat yang akan digunakan agar tidak mengganggu hasil praktikum. Sebanyak 100 mL n-butanol, 24 mL asam asetat glasial, dan 100 mL akuades dimasukkan ke dalam corong pisah. Corong pisah dikocok dengan kuat kemudian didiamkan hingga terbentuk 2 lapisan. Lapisan bawah dikaluarkan dan digunakan untuk menjenuhkan ruang kromatografi. Lapisan atas diginakan sebagai larutan elusi. Selanjutnya disiapkan dua buah kertas kromatografi dengan ukuran 25 cm x 15 cm. Pada jarak 1,5 cm dari bagian bawah kertas dibuat garis sebagai letak sampel yang akan diuji. Pada kertas pertama ditotolkan 8 larutan asam amino yaitu sistein, penilalanin, leusin, glisin, arginine, valin, triptofan dan tirosin. Sedangkan pada kertas kedua ditotolkan sampel unknown A, B, C, D, dan E. Kedua kertas yang telah berisi sampel dimasukkan ke dalam ruang kromatografi yang telah berisi larutan elusi dari campuran n-butanol, asam asetat glasial, dan akuades. Ketika eluen telah bergerak sejauh 10 cm, kertas kromatografi diambil kemudian dikeringkan dengan pemanas listrik. Setelah kering, kertas kromatografi disemprot dengan larutan ninhidrin dan kemudian dikeringkan lagi. Jarak yang ditempuh masing-masing sampel kemudian dicatat dan dicari harga Rfnya. Selanjutnya dilakukan percobaan yang sama dengan mengganti larutan elusinya. Larutan elusi kedua yang dipakai yaitu fenol dengan lengkah-langkah yang sama. 

HASIL DAN PEMBAHASAN 

Percobaan penentuan asam amino yang terdapat pada sampel unknown ini dilakukan dengan metode kromatografi kertas. Percobaan ini menggunakan dua jenis eluen. Eluen pertama yaitu campuran n-butanol, asam asetat glasial, dan akuades, sedangkan eluen kedua yaitu fenol. Kertas kromatografi disiapkan dua buah sesuai dengan prosedur kerja. Kertas pertama ditotolkan 8 larutan asam amino standar dengan urutan sebagai berikut sistein, penilalanin, leusin, glisin, arginine, valin, triptofan dan tirosin. Pada kertas kedua ditotolkan sampel unknown dengan urutan A, B, C, D, dan E. Jarak antar sampel kurang lebih 1,5 cm yang bertujuan agar sampel yang ada tidak saling tercampur pada saat proses kromatografi dilakukan. Eluen dimasukkan ke dalam ruang kromatografi setelah sebelumnya ruang kromatografi dijenuhkan. Penjenuhan berfungsi untuk mempercepat proses elusi oleh eluen. Kemudian kedua kertas kromatografi yang telah berisi sampel juga dimasukkan ke dalam ruang kromatografi. Mekanisme yang terjadi yaitu komponen polar dari eluen yaitu air akan teradsorpsi pada kertas tersusun atas selulosa. Molekul-molekul air yang bersifat polar akan terdistribusi pada permukaan kertas sebagai fase diam. Pada saat fase diam (polar) ini dilewati oleh eluen yang bersifat nonpolar (n-butana dan fenol), akan terjadi pemisahan sampel yang disebabkan oleh perbedaan distribusi asam amino yang menyusun campuran asam amino dalam fasa gerak dan air (fasa diam). Pada saat percobaan, kertas kromatografi tidak boleh disentuh dengan tangan karena tangan manusia menghasilkan menghasilkan zat organik. Salah satunya adalah asam amino yang dapat mengganggu dalam pengamatan perhitungan Rf. Elusi dihentikan ketika eluen telah menempuh jarak kurang lebih 10 cm dari tempat sampel ditotolkan. Kemudian kertas diambil dari ruang kromatografi. Kromatogram yang masih basah dikeringkan dengan pemanas listrik agar air yang terdapat pada kromatogram menguap. Penguapan air bertujuan agar ninhindrin yang akan disemprotkan dapat bereaksi dengan asam amino. Setelah kromatogram kering, larutan ninhidrin disemprotkan ke kromatogram dan dikeringkan lagi. Hasilnya adalah terbentuk warna biru pada kromatogram yang menunjukkan jarak tempuh sampel. Warna biru ini merupakan kompleks yang terbentuk oeh reaksi ninhidrin dan asam amino. Reaksi yang terjadi dapat dilihat pada Gambar dibawah ini:

Dari hasil percobaan kromatografi ini diketahui jarak tempuh masing-masing eluen, sampel asam amino standar, dan sampel unknown. Jarak yang ditempuh eluen campuran n-butanol, asam asetat glasial dan akuades pada sampel asam amino standard an sampel unknown adalah 10 cm. Sedangkan jarak yang ditempuh oleh eluen fenol pada sampel standar adalah 11,4 cm, dan pada sampel unknown adalah 12,6 cm. Dari data Rf yang telah didapatkan, dapat diperkirakan jenis asam amino yang terkandung dalam sampel unknown. Dari data tersebut sampel unknown A pada kromatografi dengan eluen campuran n-butanol dan asam asetat glasial memiliki harga Rf sebesar 0,34. Nilai ini dekat dengan harga Rf dari sistein yaitu sebesar 0,37. Pada kromatografi dengan eluen fenol, harga Rf sampel unknown A sebesar 1 yang sama dengan Rf dari Valin dan dekat dengan Rf dari leusin yaitu 0,99. Harga Rf sampel unknow B pada kromatografi dengan eluen campuran n-butanol dan asam asetat glasial sebesar 0,72 yang dekat dengan harga Rf dari leusin yaitu 0,75.  Pada kromatografi dengan eluen fenol, harga Rf sampel unknown B sebesar 0,82 dan tidak terdapat asam amino yang memiliki harga Rf yang dekat. Harga Rf sampel unknow C pada kromatografi dengan eluen campuran n-butanol dan asam asetat glasial sebesar 0,83 dan tidak terdapat asam amino yang memiliki harga Rf yang dekat. Pada kromatografi dengan eluen fenol, harga Rf sampel unknown C sebesar 0,88 yang dekat dengan harga Rf dari tirosin yaitu 0,87. Harga Rf sampel unknow D  terakhir yaitu 0,24.  

SIMPULAN 

Dari hasil percobaan dan pembahasan yang telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa (1) sampel unknown A mengandung sistein dan valin; (2) sampel unknown B mengandung leusin; (3) sampel unknown C mengandung tirosin; (4) sampel unknown D mengandung glisin dan arginin; (5) sampel unknown E mengandung fenilalanin dan arginin. 5. 

Daftar Pustaka

Fessenden & Fessenden. 2010. Fundamentals of 

Organik Chemistry alih bahasa Dra. Sukmariah Maun, dkk. Jakarta: Binarupa Aksara Publisher 

Poedjiana, A., & Supriyanti, T. (2009).Dasar. 

Tika, I Nyoman. 2010. 

Penuntun praktikum Biokimia. Singaraja: Universitas Pendidikan Ganesh