Di suatu tempat di Islandia, seorang agen rahasia perempuan CIA bernama Nicky Persons (Julia Stiles) yang pernah membantu Bourne dalam pelariannya di dua film Bourne sebelumnya, datang ke sebuah lokasi rahasia CIA. Ia kemudian secara diam-diam meretas dan mencuri data rahasia dari komputer CIA di sana.
Upaya peretasan data itu diketahui oleh  Kepala Divisi Operasional cyber-spy CIA yang berada di kantor pusat CIA di New York bernama Heather Lee (Alicia Vikander), ia berusaha menghentikan upaya peretasan itu, tetapi terlambat. Data rahasia itu berhasil dicuri dan disimpan di sebuah USB, dibawa lari oleh Nicky Persons.
Direktur CIA Robert Dewey (Tommy Lee Jones) segera memerintahkan pelacakan dan pengejaran besar-besaran terhadap keberadaan Nicky Persons, menggunakan kecanggihan berbagai teknologi pelacakan canggih milik CIA.
Robert Dewey berkata kepada Heather Lee bahwa data itu akan sangat berbahaya jika sampai jatuh di tangan Bourne, karena di situ terdapat program rahasia CIA terbaru bernama Ironhead, juga ada data-data yang bisa digunakan Bourne untuk menghancurkan CIA.
Maka itu Lee harus segera dapat melacak keberadaan data itu dan menghancurkannya. Heather Lee mengatakan kepada Dewey bahwa ia telah memasang malware di data tersebut sehingga ketika dibuka akan secara otomatis melacak lokasi di tempat mana data itu dibuka. Setelah terlacak ia dapat mengendalikan data itu dari jarak jauh dengan menghapuskannya.
Pelacakan satelit mata-mata CIA berhasil menemukan Nicky Persons di Yunani, ternyata ia pergi ke sana menemui Jason Bourne untuk menyerahkan data terebut kepada Bourne.
Mengetahui hal itu, Dewey langsung memerintahkan agen-agen rahasia CIA di Yunani untuk memburu Nicky Persons dan Jason Bourne. Secara diam-diam ia pun menghubungi seorang pembunuh bayaran profesional bernama Asset (Vincent Cassel) untuk membunuh Jason Bourne dan Nicky Persons.
Perburuan pun segera dimulai seperti film-film Bourne sebelumnya, kali ini lokasinya di Athena, Yunani (di tengah-tengah terjadinya kerusuhan akibat demonstrasi massa), Madrid, New York, dan berakhir di Las Vegas.
Data yang berhasil dibuka oleh Bourne itu ternyata mengungkapkan suatu rahasia baru masa lalunya yang masih berkaitan dengan program Blackbrair, Treadstone, Â Robert Dewey, dan dengan ayahnya; Richard Webb (Gregg Henry).
Richard Webb adalah seorang ahli analisis CIA, yang beberapa tahun lalu sebelum program Blacbrair dimulai, Â tewas oleh bom mobil hanya beberapa saat setelah bertemu dengan anaknya; David Webb (Jason Bourne).
Dari data itu pula Bourne berhasil mengetahui siapa sebenarnya  pembunuh dan otak pembunuhan ayahnya itu, dan kenapa pembunuhan itu dilakukan.
