Penggunaan Kromatografi Kertas dalam Praktikum Pemisahan Asam Amino dari Sampel Unknown

Kromatografi merupakan suatu metode yang didasarkan atas distribusi diferensial komponen sampel diantara dua fase yaitu fase diam dan fase gerak.  Padatan atau cairan yang terikat pada permukaan padatan (kertas atau suatu absorben) dapat disebut sebagai fase diam. Sedangkan cairan disebut eluen atau pelarut, atau gas pembawa yang inert dapat disebut sebagai fase gerak. Gerakan fasa gerak ini mengakibatkan terjadinya migrasi diferensial komponen-komponen dalam sampel (Tika, 2010). 

Berdasarkan sifat nya, metode analisis dapat dibagi menjadi dua jenis, yaitu konvensional dan modern. Kromatografi modern meruapakn teknik pemisahan komponen aktif dari suatu senyawa dengan berat molekul yang tinggi menggunakan instrument canggih, seperti HPLC (High Performance Liquid Cromatography) dan GC-MS (Gas Cromatography-Mass Spectrophotometry). Sedangkan kromatografi konvensional merupakan teknik pemisahan yang dilakukan menggunakan isntrumen sederhana, seperti kromatografi kertas,kromatografi kolom, dan kromatografi lapis tipis. (Buku Informasi, 2018).

Metode kromatografi kertas merupakan suatu teknik pemisahan sederhana atau konvensional yang digunakan untuk memisahkan komponen pigmen (Mubarok, 2021). Kromatografi kertas dapat dikatakan sebagai bidang khusus kromatografi cair -- cair. Fasa diam berupa lapis tipis cairan yang terserap oleh kertas. Pengerjaannya sangat sederhana. Penempatan satu tetes cuplikan pada ujung kertas dan kemudian mencelupkannya ke dalam pelarut (eluen) sudah cukup untuk memisahkan komponen-komponen cuplikan (Tika, 2010). 

Dalam kromatografi kertas komponen yang dipisahkan harus larut dalam fase gerak dan harus memiliki kemampuan untuk berinteraksi dengan fase diam dengan cara melarut di dalamnya, teradsorpsi, atau berinteraksi secara kimia (penukar ion). Pemisahan terjadi didasarkan atas perbedaan migrasi zat-zat yang menyusun suatu sampel (Soebagio,dkk., 2003). Pada kromatografi kertas, zat ditempatkan dengan pipa kapiler pada kertas, kemudian campuran pelarut (eluen) bermigrasi melewati noda (spot) dengan arah ke atas (ascending) atau ke bawah (descending). Kestabilan kertas, pelarut yang dipilih, dan temperature sangat dapat mempengaruhi cepat lambatnya proses migrasi (Christina, 2019)

Setiap benda ataupun makhluk hidup di dunia mengandung banyak senyawa-senyawa kimia di dalamnya. Baik itu senyawa organic maupun anorganik. Salah satu senyawa organic yang terkandung dalam makhluk hidup adalah asam amino. Christina (2019) meyebutkan asam amino merupakan molekul organik dengan massa molekul rendah (antara 100-200Da) yang mengandung setidak-tidaknya yaitu satu gugus karboksil (-COOH) dan satu gugus amino (-NH2). 

Asam amino sangat berperan penting dalam kehidupan manusia, seperti memastikan pembelahan sel terjadi dengan sempurna, dalam tubuh berjalan lancar metabolisme, memelihara daya ingat, pertumbuhan, penyembuhan hingga sebagai bangunan blok protein yang linear dari rantai asam amino. Asam amino yang terkandung dalam makhluk hidup (yang selanjutnya disebut sampel) dapat dipisahkan menggunakan metode kromatografi kertas.

Dalam percobaan ini dilakukan analisis secara kualitatif terhadap larutan yang mengandung bermacam-macam asam amino. Pengamatan yang dilakukan cukup sulit mengingat asam amino yang terlarut tidak menunjukkan warna tertentu. Untuk mengantisipasi hal tersebut, maka setelah elusi dihentikan, posisi eluen ditandai dengan pensil, lalu kromatogram dikeringkan dan selanjutnya disemprot dengan larutan ninhidrin. 

Ketika asam amino bereaksi dengan ninhidrin terjadi pelepasan CO2 dan NH3 sehingga asam amino dapat ditentukan secara kuantitatif dengan mengukur jumlah CO2 atau NH3 yang dilepaskan. Prolin dan hidroksi prolin menghasilkan kompleks yang berbeda warnanya dengan asam amino lainnya. Kompleks berwarna yang terbentuk mengandung dua molekul ninhidrin yang bereaksi dengan amonia yang dilepaskan pada oksidasi asam amino. Keseluruhan reaksi asam amino dengan ninhidrin adalah sebagai berikut: (1) dekarboksilasi oksidatif dari asam amino dan produksi ninhidrin tereduksi, amonia, dan karbon dioksida (2) reaksi ninhidrin tereduksi dengan molekul ninhidrin yang lain dan dengan molekul amonia yang dibebaskan dan (3) pembentukan kompleks berwarna biru (Tika, 2010).

Setiap komponen memiliki harga Rf tertentu. Jarak yang ditempuh oleh setiap senyawa dari garis dasar relatif terhadap jarak tempuh pelarut/eluen didefinisikan sebagai Rf (retordation factor).

Nilai Rf dari suatu senyawa pada sistem kromatografi kertas bergantung pada banyak faktor, seperti  pelarut, temperatur, sifat dari campuran, dan jenis kertas yang digunakan.

Mubarok (2021) menjelaskan faktor-faktor yang mempengaruhi nilai Rf, yaitu sebagai berikut.

• Pelarut
• Pelarut dapat mempengaruhi nilai Rf karena dapat mengubah koefisien partisi. Adanya perubahan-perubahan kecil dalam komposisi pelarut dapat menyebabkan perubahan pada nilai Rf.
• Temperatur
• Temperatur dapat mempengaruhi nilai Rf karena perubahan temperature dapat mempengaruhi perubahan koefisien partisi dan kecepatan aliran.
• Sifat dari campuran
• Berbagai senyawa mengalami partisi di antara volume yang sama dari fase diam dan fase gerak, sehingga dapat mempengaruhi karakteristik kelarutan zat satu terhadap zat lainnya hingga nilai Rf.
• Jenis kertas
• Kertas yang digunakan dapat memperngaruhi nilai Rf karena adanya perbedaan ion dan serapan pada kertas-kertas yang umum digunakan dalam kromatografi kertas. Selain itu, jenis kertas mempengaruhi kecepatan aliran dan keseimbangan partisi dalam kromatografi kertas.