. Oleh karena pengaruh faktor-faktor tersebut, nilai Rf suatu senyawa yang sudah diketahui dijadikan standar atau patokan untuk menentukan Rf senyawa lainnya. Untuk analisa kualitatif, senyawa tertentu yang sudah diketahui digunakan bersama-sama dengan senyawa yang akan diidentifikasi. Dua senyawa yang berbeda dalam satu sistem pelarut tertentu dapat memiliki nilai Rf yang sama. Oleh karena itu, hasil analisa yang diperoleh dengan teknik kromatografi kertas, harus dijustifikasi dengan metode lain. Untuk mengukur nilai Rf memerlukan melokalisir permukaan pelarut. Nilai Rf biasanya dinyatakan dalam bentuk fraksi/bagian. Perbedaan nilai Rf untuk dua senyawa yang dipisahkan bergantung pada besar noda-noda dan panjang aliran zat terlarut.
Senyawa yang dianalisa dengan teknik kromatografi kertas dapat ditentukan lokasinya pada kertas dengan berbagai cara. Bila senyawa yang diuji menyerap sinar UV atau berfluoresensi dengan sinar UV, noda atau spot dapat dideteksi dengan penyinaran menggunakan sinar UV di tempat yang gelap (Redhana, 2010).
Alat dan Bahan
Dalam percobaan pemisahan asam amino dari sampel unknown menggunakan kromatografi kertas, alat yang digunakan adalah pipet kapiler, ruang kromatografi, spatula, corong pisah, penggaris, gunting, heater, penyemprot, gelas kimia (250 mL, 100 mL) dan pipet tetes. Bahan-bahan yang diperlukan dalam percobaan ini adalah aquades, larutan n-butanol, asam asetat glasial, kertas kromatografi, fenol, larutan ninhidrin, larutan triptofan, larutan leusin, larutan tirosin, larutan metionin, larutan glisin, larutan sampel A, larutan sampel B, dan larutan sampel C.
Prosedur Kerja
- Pembuatan Larutan Elusi
- 100 mL larutan n-butanol ditambahkan dengan 100 mL aquades dan 24 mL asam asetat
- Ketiga larutan tersebut ditempatkan dalam corong pisah dan dikocok.
- Kedua lapisan yang terbentuk kemudian dipisahkan.
- Sebanyak 100 mL larutan fenol disaring dari larutannya sehingga didapatkan larutan bening yang bersih dari pengotor.
- Penyiapan Kertas Kromatografi
- Kertas kromatografi disiapkan dengan ukuran yang disesuaikan dengan wadah kromatografi
- Pada bagian sekitar 1,5 cm dari tepi bawah kertas ditandai dengan pensil
- Proses Kromatografi dengan Menggunakan Eluen Campuran n-Butanol, Aquades, dan Asam Asetat Glasial
- Kertas kromatografi 15 x 25 cm ditandai dengan menggunakan pensil 1,5 cm dari tepi bawah.
- Larutan standar asam amino dan sampel ditotolkan berdampingan dengan jarak 1,5 cm. larutan ujung terletak 2 cm dari pinggir kertas, lalu dikeringkan
- Kertas kromatografi digantungkan dalam ruang kromatografi.
- Elusi dihentikan ketika eluen menempuh jarak 10 cm dan ditandai dengan pensil.
- Kertas dikeringkan pada suhu 105-1100C.
- kertas disemprot dengan larutan ninhidrin dan dikeringkan kembali.
- Jarak noda--noda diukur dan dihitung harga Rf-nya.
- Proses Kromatografi dengan Menggunakan Eluen Fenol
- Kertas kromatografi dengan ukuran 15 x 25 cm ditotolkan dengan larutan uji menggunakan pipa kapiler dengan jarak totolan 1,5 cm dengan besar noda lebih kecil atau sama dengan 0,4 cm.
- Kertas kromatografi yang telah ditotolkan sampel kemudian digantung dalam ruang kromatografi selama beberapa jam agar elusi berjalan.
- Setelah larutan elusi berjalan kurang lebih 10 cm dari batas sampel, elusi dihentikan dan kertas kromatografi dikeluarkan.
- Batas larutan ditandai dengan menggunakan pensil dan kertas kromatografi dikeringkan pada suhu 100--1050C.
- Kertas yang telah dikeringkan disemprot dengan larutan ninhidrin dan dikeringkan.
- Jarak eluen dengan jarak warna yang terbentuk diukur.
Refrensi:
Purba, Michael. 2004. Kimia Untuk SMA Kelas XII. Jakarta: Erlangga
Redhana, I Wayan. 2010. Penuntun Praktikum Biokimia. Singaraja : Universitas Pendidikan Ganesha
Soebagio, dkk. 2003. Kimia Analitik II. Malang: IMSTEP
Tika, I Nyoman. 2010. Penuntun Praktikum Biokimia. Singaraja: Universitas Pendidikan Ganesha.
Buku Informasi Melaksanakan Analisa Secara Kromatografi Konvensional Mengikuti Prosedur. 2018. Â Jakarta: Pusat Pengembangan dan Pemberdayaan Pendidik dan Tenaga Kependidikan Pertnian.
