Ekstraksi DNA merupakan proses pengambilan dan pemurnian DNA dari sampel biologis seperti darah, jaringan, atau sel. DNA sendiri merupakan materi genetik yang mengandung informasi genetik suatu organisme. DNA dengan bobot molekul yang tinggi atau High Molecular Weight DNA (HMW DNA) memiliki ukuran panjang atau jumlah pasangan basa yang banyak dan sangat penting untuk Next-Generation Sequencing (NGS) yang membutuhkan fragmen DNA yang Panjang atau yang disebut dengan long-read sequencing untuk mendapatkan informasi genetik yang lebih lengkap.
Permasalahan dalam Ekstraksi DNA Berbobot Molekul Tinggi
Metode konvensional seringkali menjadi metode yang mahal, memakan waktu, dan tidak menghasilkan DNA dengan kualitas dan kuantitas yang cukup untuk pembacaan sekuensing yang panjang.
Solusi: Ekstraksi Otomatis Berbasis Bead
Metode ekstraksi DNA menggunakan partikel kecil (bead-based) yang dilapisi dengan bahan kimia khusus untuk mengikat DNA dan dipisahkan dari kontaminan lain melalui proses magnetik atau sentrifugasi. Seluruh proses ekstraksi DNA dapat dilakukan secara otomatis mulai dari penambahan reagen hingga pemurnian DNA akhir. Ekstraksi DNA yang dikerjakan secara otomatisasi dapat mengurangi human error dan meningkatkan efisiensi. Metode ini sangat berguna untuk penelitian genomik yang membutuhkan data sekuensing DNA dengan resolusi tinggi,
Menggunakan bead silika-coated dan kimia paten untuk menangkap fragmen DNA panjang, mengurangi jumlah fragmen kecil yang tidak diinginkan. Menggunakan liquid handler SPT Labtech firefly untuk proses ekstraksi yang cepat dan efisien, dengan sedikit campur tangan manusia. Esktraksi DNA dengan liquid handler SPT Labtech firefly tidak memerlukan proses seleksi ukuran yang memakan waktu panjang dan boros penggunaan reagen. Penggunaan liquid handler membantu DNA yang diekstraksi dapat langsung digunakan untuk library preparation dan sekuensing, misalnya dengan menggunakan sistem Oxford Nanopore Technologies (ONT). Ekstraksi otomatis berbasis bead ini menghasilkan HMW DNA berkualitas tinggi untuk persiapan dan sekuensing perpustakaan Nanopore dalam waktu kurang dari 2 jam. Selain itu, Firefly mengganti penambahan reagen pipet dispensing non-kontak yang dapat mengurangi jumlah konsumsi plastik sekali pakai, membuat seluruh protokol tidak hanya lebih cepat tetapi juga lebih ramah lingkungan.
Metode
200 L aliquot kultur E.coli NCTC 13400 dilakukan ekstraksi HMW DNA dengan menggunakan firefly. Pelet E.coli beku dicairkan, disuspensikan dalam buffer STET yang dilengkapi dengan lisozim dan dimuat ke dalam pelat 96-well. Ekstraksi berbasis magnetic beads HMW DNA selanjutnya menggunakan kit Fire Monkey RevoluGen dan sepenuhnya otomatis pada instrumen firefly.
Sampel kontrol (CTRL) disiapkan dari E.coli yang sama dengan mengikuti protokol manual. Library preparation disiapkan dari 8 sampel firefly dan sampel CTRL yang menggunakan Kit Sekuensing Ligasi V14 (SQK-LSK114), kemudian kedua sampel firefly dan CTRL disekuensing pada instrumen ONT MinION dengan R10 (FLO-MIN114).
Layout Awal Deck Firefly untuk Ekstraksi DNA HMW Berbasis Magnetic Bead Fire Monkey Otomatis (Dokpri)
Evaluasi Performa Ekstraksi Otomatis
Panjang Fragmen DNA dan Hasil yang Diperoleh setelah Ekstraksi Manual (CTRL) dan Ekstraksi dengan Bantuan Firefly (A1-A8) (Dokpri)
Gambar di atas menunjukkan bahwa alur kerja otomatis dengan menggunakan firefly menunjukkan hasil kuat seperti yang ditunjukkan dengan %CV yang rendah antara pengulangan. CV sebesar 7,6% diamati untuk distribusi ukuran fragmen rata-rata (rentang: 149kb-191kb) dan 12% untuk hasil HMW DNA (rentang: 2,7-3,9 g).
Nanopore Sequencing Data
Data sekuensing Nanopore tunggal yang dikumpulkan pada titik waktu yang berbeda. (Dokpri)