Alkisah pada 1995, di pedalaman negara bagian Ohio, Amerika Serikat tinggalah satu keluarga yang terdiri dari Alexei (ayah), Melina (ibu) dan dua anaknya Natasha dan adiknya Yelena. Keluarga yang sepintas tampak harmonis itu adalah samaran dari agen Rusia.
Mereka ketahuan dan keluarga itu lari ke Kuba lewat kejar-kejaran dan baku tembak yang menyebabkan Melina tertembak, Natasha dan Melina dikirim kembali ke Red Room untuk menjalani pemrograman.
Singkatnya Red Room adalah tempat untuk melatih satu pasukan yang semuanya perempuan yang dinamakan Black Widow. Pimpinannya Drekov (Ray Winstone).
Adegan pembuka "Black Widow" menyingkap masa lalu Natasha Romanov (Scarlett Johansson), salah seorang Avengers. Film ini mengambil setting pasca sekuel Civil War di mana natasha awalnya ada di tim Tony Stark, akhirnya membantu pelarian Captain Americana dengan menyerang King Wakanda. Tindakan ini membuat dia diburu oleh pemerintah Amerika Serikat.
Diceritakan, Natasha berkumpul kembali dengan Yelena Belova (Florence Pugh), Melina (Rachel Weisz), dan Alexei alias Red Guardian (David Harbour).
Yelena awalnya pembunuh terampil. Dalam sebuah insiden di Maroko dia membelot dari barisan Dreykov, setelah terbebas dari alat pelacak yang ditanam di bawah kulitnya.
Dia kemudian mendapatkan kotak botol berisi penangkal senyawa kimia Dreykov yang dirancang untuk menghambat kehendak bebas.
Natasha dan Yelena kemudian mengetahui bahwa Red Room merupakan lahan bisnis pimpinannya Dreykov (Ray Winstone). Di tempat tersebut, perempuan sebayanya dimanipulasi secara kimiawi untuk menjadi pembunuh tanpa kendali mereka sendiri. Apakah tokoh ini merupakan simbol agen KGB yang menjadi semacam ronin (istilah untuk samurai Jepang tak bertuan) pasca keruntuhan Soviet?
Yang menarik Red Guardian ini sebetulnya diprogram untuk menjadi "Captain America"-nya Rusia. Tokoh ini unik, konyol, berbeda bak bumi dan langit dengan Captain America.
Spin off dari Avengers ini menghadapkan Natasha dan ketiga kawannya menghadapi Dreykov dan Black Widow-nya, termasuk andalan utamanya, villian bernama Taskmaster yang terkait dengan aksi Natasha di masa lalu.